賴(lài)婷，朱燕，陳琳，潘佩英

貴陽(yáng)市婦幼保健院婦科，貴陽(yáng) 550003

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命安全。早期宮頸癌的治愈率較高，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的早期診治是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的有效手段[1]。低級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）作為宮頸癌前病變的階段性改變，自然逆轉(zhuǎn)率較高，但目前CIN的診斷及分級(jí)容易受到多種主觀因素的影響，從而影響臨床治療策略的選擇。高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染與CIN及宮頸癌的發(fā)生有直接關(guān)系[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，HPV DNA檢測(cè)能夠明顯降低宮頸癌的發(fā)生率和病死率，其中，E6/E7mRNA是病毒癌基因E6、E7的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，能夠促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。有研究認(rèn)為，抑癌基因突變、原癌基因激活等在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4]。p16作為一種抑癌基因，其失活后能夠引起宿主細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)。Ki-67能夠加快腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并反映腫瘤細(xì)胞的增殖速度，且病變程度越高，其表達(dá)水平越高。本研究探討HPVE6/E7mRNA聯(lián)合p16、Ki-67檢測(cè)對(duì)LSIL的預(yù)測(cè)價(jià)值，旨在為L(zhǎng)SIL的預(yù)后評(píng)價(jià)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年8月至2018年6月貴陽(yáng)市婦幼保健院收治的宮頸病變患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：患者3日內(nèi)無(wú)性生活或未行陰道沖洗及用藥；既往無(wú)CIN病史；肝、腎等功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并免疫系統(tǒng)疾病，有免疫抑制藥物治療史；近期有陰道及宮頸病變治療史；妊娠期或哺乳期婦女；其他良惡性腫瘤患者。根據(jù)納入和排出標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入222例宮頸病變患者，其中，LSIL患者的LSIL組織標(biāo)本80例，患者的年齡28～64歲，平均（39.16±6.84）歲；平均孕次（2.75±0.42）次；平均產(chǎn)次（1.58±0.26）次；高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade cervical squamous intraepithelial lesion，HSIL）患者的HSIL組織標(biāo)本73例，患者的年齡26～68歲，平均（40.07±5.49）歲；平均孕次（2.84±0.38）次；平均產(chǎn)次（1.63±0.21）次。同期選擇因子宮腺肌病或子宮肌瘤進(jìn)行子宮切除術(shù)的患者的正常宮頸組織標(biāo)本69例，患者的年齡25～64歲，平均（40.68±5.11）歲；平均孕次（2.79±0.41）次；平均產(chǎn)次（1.61±0.19）次。所有患者的年齡、平均孕次、平均產(chǎn)次比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 HPVE6/E7mRNA 檢測(cè) 采用支鏈DNA技術(shù)測(cè)定所有患者HPVE6/E7mRNA的表達(dá)情況。采用一次性宮頸采樣刷收集宮頸脫落細(xì)胞，放置于細(xì)胞保存液中。將裂解液置于37℃恒溫箱中，10 min后取出進(jìn)行標(biāo)本漂洗；再進(jìn)行標(biāo)本裂解、目的RNA釋放，配制標(biāo)本和緩沖液，布板，雜交捕獲目的核糖核酸（RNA），信號(hào)預(yù)放大，信號(hào)放大—放大分子結(jié)合，并標(biāo)記探針結(jié)合，生成化學(xué)發(fā)光信號(hào)，再加入標(biāo)記熒光物質(zhì)的對(duì)應(yīng)底物，讀板。結(jié)果判定：拷貝數(shù)≥1 copy/ml為檢測(cè)陽(yáng)性（+），反之為陰性（-）。

1.2.2 p16、Ki-67檢測(cè) 手術(shù)收集宮頸組織，置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫箱中保存待用；標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm層厚連續(xù)切片，置于切片漂烘溫控儀，38℃下將連續(xù)切片展開(kāi)；取處理后的載玻片切片，脫蠟；高溫、高壓修復(fù)抗原，按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟、采用免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定p16、Ki-67的表達(dá)情況。p16陽(yáng)性結(jié)果判定：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒；Ki-67陽(yáng)性結(jié)果判定：細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒。

1.3 隨訪

對(duì)80例LISL患者進(jìn)行為期12個(gè)月的隨訪，期間未進(jìn)行抗HPV相關(guān)治療。隨訪結(jié)果：①進(jìn)展。組織病理學(xué)結(jié)果提示為HSIL或以上級(jí)別。②持續(xù)。組織病理學(xué)結(jié)果提示仍為L(zhǎng)SIL。③消退。高危型（high risk，HR）-HPV DNA和液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thinprep cytologic test，TCT）檢測(cè)結(jié)果均提示正常，或HR-HPV DNA、TCT檢測(cè)結(jié)果提示異常，但組織病理學(xué)檢測(cè)正常。持續(xù)及消退均判定為無(wú)進(jìn)展。依據(jù)相關(guān)指南[5]判定病情進(jìn)展。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67表達(dá)情況的比較

HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67在正常宮頸組織中不表達(dá)，在LSIL組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.50%（42/80）、40.00%（32/80）、45.00%（36/80），在HSIL組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.82%（59/73）、64.38%（47/73）、71.23%（52/73），3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=95.916、65.210、76.727，P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中HPV E6/E7 mRNA、p16、Ki-67的表達(dá)情況

2.2 HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67與LSIL進(jìn)展的關(guān)系

LSIL進(jìn)展患者的組織中HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)較高，且均明顯高于LSIL未進(jìn)展患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.647、14.180、14.596，P＜0.01）。（表2）

2.3 LSIL組織中HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LSIL組織中HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67之間的表達(dá)兩兩呈正相關(guān)（P＜0.05）。LSIL組織中HPVE6/E7mRNA與p16的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.487，P=0.013），HPVE6/E7mRNA與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.531，P=0.004），p16與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.602，P=0.001）。

表2 不同LSIL進(jìn)展情況的患者組織中HPV E6/E7 mRNA、p16、Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)情況[n（%）]

3 討論

CIN為宮頸癌的癌前病變，其中，大部分LSIL能夠自然消退，少部分繼續(xù)進(jìn)展；HSIL則容易進(jìn)展為宮頸癌，二者的治療方式不同[6]。提高對(duì)CIN分級(jí)的診斷水平不僅能夠減少宮頸癌的發(fā)生，還可避免過(guò)度治療。但二者的組織形態(tài)學(xué)具有連續(xù)病變，無(wú)明確分界線，因此診斷上有一定難度。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)篩查是宮頸癌篩查的常用手段，特異度較高，但單獨(dú)應(yīng)用有漏診CIN的可能性。

近年來(lái)，隨著HPV感染與生殖道關(guān)系研究的深入，有文獻(xiàn)報(bào)道，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但不同亞型的HPV病毒對(duì)宮頸病變發(fā)生的影響不同[7]。E6、E7mRNA的表達(dá)情況能夠客觀反映腫瘤基因的活性。研究表明，HPVE6/E7mRNA的表達(dá)與宮頸病變的程度和預(yù)后有一定相關(guān)性[8]。E6蛋白通過(guò)與細(xì)胞泛素酶E3及P53結(jié)合促進(jìn)P53的降解，影響細(xì)胞調(diào)控，誘導(dǎo)病毒復(fù)制[9]。另外，E6蛋白可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，增加CIN及宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[10]。E7與Rb蛋白特異性結(jié)合后可影響細(xì)胞的正常調(diào)控途徑，導(dǎo)致細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分裂。E6與E7蛋白的協(xié)同作用能夠影響干擾素基因的表達(dá)，導(dǎo)致HPV病毒不受免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，加速腫瘤進(jìn)展[11]。E2蛋白可抑制E6、E7的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，避免宮頸病變的發(fā)生，但HPV病毒進(jìn)入機(jī)體上皮細(xì)胞后可導(dǎo)致E2基因表達(dá)缺失，從而引起E6、E7過(guò)度表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，正常宮頸組織中無(wú)HPVE6/E7mRNA表達(dá)，HSIL組織中HPVE6/E7mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于LSIL組織，表明HPVE6/E7mRNA的檢測(cè)能夠一定程度地反映宮頸病變情況，從而指導(dǎo)臨床治療，避免治療不及時(shí)或過(guò)度治療。CIN具有自然轉(zhuǎn)歸的現(xiàn)象，但隨著CIN級(jí)別的升高，其自然逆轉(zhuǎn)率可相應(yīng)降低，病變進(jìn)展的可能性隨之增加。本研究發(fā)現(xiàn)，LSIL進(jìn)展患者組織中HPVE6/E7mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)較高，提示HPVE6/E7mRNA陽(yáng)性表達(dá)的LSIL患者發(fā)生進(jìn)展的可能性較高，建議予以更積極的治療方案。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化染色技術(shù)能夠提高CIN診斷的可重復(fù)性，p16基因是直接作用于細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞無(wú)限分裂及增殖的抑癌基因[13]。p16基因能夠抑制DNA合成的啟動(dòng)，通過(guò)負(fù)性調(diào)控相關(guān)環(huán)路，在減緩細(xì)胞的進(jìn)展中起重要作用，其變異可導(dǎo)致此環(huán)路無(wú)限循環(huán)，影響細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[14]，另外其表達(dá)的增強(qiáng)可參與細(xì)胞的衰老，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。p16基因能夠在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成5-甲基胞嘧啶，甲基化后難以解聚，阻止基因的啟動(dòng)及轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究證實(shí)，p16基因高甲基化失活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15]。HPV E7蛋白和Rb蛋白結(jié)合后可抑制Rb蛋白的生長(zhǎng)，促進(jìn)p16的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白的表達(dá)有利于宮頸癌的篩查。另外，本研究結(jié)果顯示，p16陽(yáng)性的LSIL患者的進(jìn)展率相對(duì)較高，表明p16測(cè)定對(duì)預(yù)測(cè)宮頸病變的結(jié)局具有重要意義。

Ki-67作為一種核蛋白，與細(xì)胞代謝及合成相關(guān)，其半衰期較短，與腫瘤細(xì)胞增殖的活躍程度有相關(guān)性[16]。既往研究表明，Ki-67能夠反映腫瘤的生物學(xué)特性，與宮頸病變的程度相關(guān)，可作為診治及預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)[17]。王宇華等[18]研究表明，Ki-67能夠提高診斷宮頸病變的特異度和靈敏度，優(yōu)化診療途徑，為患者提供合理的管理方案。本研究中，Ki-67在不同級(jí)別CIN組織中的表達(dá)有明顯分層現(xiàn)象，提示隨著腫瘤細(xì)胞增殖速度的增加，Ki-67的表達(dá)越強(qiáng)；隨訪發(fā)現(xiàn)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)的LSIL患者的進(jìn)展率相對(duì)較高，從而一定程度地反映預(yù)后。Celewicz等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生是多基因、多因素協(xié)同作用的結(jié)果，p16、Ki-67聯(lián)合檢測(cè)可作為鑒別宮頸病變的重要標(biāo)記物。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，LSIL組織中HPVE6/E7mRNA、p16、Ki-67的表達(dá)均呈正相關(guān)，表明其在宮頸病變分級(jí)診斷方面可能有一定的協(xié)同作用，從而更好地評(píng)價(jià)CIN的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。

綜上所述，HPVE6/E7mRNA、p16及Ki-67在診斷CIN分級(jí)、指導(dǎo)臨床治療、預(yù)測(cè)臨床轉(zhuǎn)歸方面具有重要意義。但本研究納入的樣本量少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加結(jié)論的可靠性。