李冬雷，張旭宇，肖躍華，劉偉，張美倫

保定市第二中心醫(yī)院1腫瘤科，2耳鼻喉科，河北 保定 072750

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤，由于其發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前，喉癌主要的治療方法包括手術(shù)、放療和化療，但效果不佳。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，從分子生物學(xué)的角度尋找預(yù)測和治療喉癌的方法日益受到人們的關(guān)注。作為全能性或多能性干細(xì)胞標(biāo)志物，八聚體結(jié)合蛋白4（octamer-binding protein 4，Oct4）在保持胚胎干細(xì)胞自我更新及全能性方面作用重大。Nanog是公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志性基因，能夠抵抗放化療，調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞，去除或使該基因失活能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[1]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生及發(fā)展等生理、病理過程中起關(guān)鍵作用[2]。目前，關(guān)于Oct4和Nanog在喉癌組織中的表達(dá)及預(yù)后的相關(guān)研究相對較少。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測喉癌組織及癌旁組織中Oct4、Nanog和β-catenin的表達(dá)情況，探討Oct4、Nanog、β-catenin在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年1月至2013年9月保定市第二中心醫(yī)院收治的喉癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理證實為鱗狀細(xì)胞癌，且癌旁組織經(jīng)病理檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過放療、化療等治療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入71例患者。其中，男58例，女13例；年齡為35～84歲，平均年齡為（65.4±6.1）歲；聲門上型18例，聲門型36例，聲門下型17例；TNM分期：T1～2期32例，T3～4期39例；分化程度：高分化26例，中低分化45例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。收集71例喉癌患者的喉癌組織和對應(yīng)的癌旁組織（距喉癌組織邊緣＞0.5 cm）。

1.2 主要試劑

鼠抗人Oct4單克隆抗體、兔抗人Nanog多克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒（SP-9000）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法及結(jié)果判定

采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測Oct4、Nanog和β-catenin的表達(dá)情況，取手術(shù)后經(jīng)石蠟包埋的喉癌組織和癌旁組織切片（厚度為4 μm），分別經(jīng)二甲苯、無水乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）脫蠟處理，使用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，取出切片，使用PBS洗滌3次，每次5 min。采用微波修復(fù)法對抗原進(jìn)行修復(fù)，將切片置于pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱至沸騰后進(jìn)行冷卻，重復(fù)操作1次后用PBS清洗。清洗后取出切片，封閉10 min，加入一抗，4℃孵育12 h。孵育后洗滌，先后滴加生物素標(biāo)記的二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，4℃孵育20 min。孵育后再次洗滌，加入DAB顯色液染色5 min，之后經(jīng)沖洗、復(fù)染、脫水、封片后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。從每個切片中隨機挑選5個高倍視野并對陽性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。依據(jù)染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分：＜5%為0分，≥5%且＜25%為1分，≥25%且＜50%為2分，≥50%且＜75%為3分，≥75%為4分。染色強度評分和陽性細(xì)胞所占百分比評分相乘，≤3分為陰性表達(dá)，＞3分為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪

對喉癌患者進(jìn)行門診或電話隨訪，隨訪時間為60個月，隨訪截止時間為2017年11月。觀察記錄患者隨訪期間的生存情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kappa檢驗進(jìn)行一致性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗；采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Oct4、Nanog和β-catenin表達(dá)情況的比較

Oct4陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)；Nanog陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；β-catenin陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜。癌旁組織中Oct4、Nanog、β-catenin的陽性表達(dá)率分別為 21.13%（15/71）、15.49%（11/71）、22.54%（16/71），均明顯低于喉癌組織的45.07%（32/71）、52.11%（37/71）、49.30%（35/71），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.191、21.275、11.045，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、β-catenin陽性表達(dá)率的比較

不同年齡、性別、吸煙情況、腫瘤類型的喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、β-catenin的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中低分化、T3～4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中Oct4的陽性表達(dá)率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.457、4.495、4.262，P＜0.05）；中低分化、T3～4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中Nanog的陽性表達(dá)率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.488、1.633、5.035，P＜0.05）；中低分化、T3～4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中Nanog的陽性表達(dá)率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.633、5.189、5.117，P＜0.05）。（表1）

2.3 β-catenin與Oct4和Nanog表達(dá)的關(guān)系

一致性檢驗結(jié)果顯示，β-catenin和Oct4表達(dá)的一致性較好（Kappa=0.633，P=0.000），β-catenin和Nanog表達(dá)的一致性較差（Kappa=0.381，P=0.001）。（表 2）

表1 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、βcatenin的陽性表達(dá)情況（n=71）

表2 喉癌患者喉癌組織中β-catenin、Oct4和Nanog的表達(dá)情況

2.4 生存情況的比較

β-catenin陽性表達(dá)患者的5生存率為40.6%，低于β-catenin陰性表達(dá)患者的59.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.178，P＜0.05）；Oct4陽性表達(dá)患者的5年生存率為18.9%，低于Oct4陰性表達(dá)患者的85.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.037，P＜0.05）；Nanog陽性表達(dá)患者的5年生存率為25.7%，低于Nanog陰性表達(dá)患者的75.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.063，P＜0.05）。（圖1～圖3）

圖1 β-catenin陽性表達(dá)（n=35）和陰性表達(dá)（n=36）喉癌患者的生存曲線

圖2 Oct4陽性表達(dá)（n=32）和陰性表達(dá)（n=39）喉癌患者的生存曲線

圖3 Nanog陽性表達(dá)（n=37）和陰性表達(dá)（n=34）喉癌患者的生存曲線

2.5 喉癌患者預(yù)后影響因素的Cox 比例風(fēng)險回歸分析

Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及β-catenin、Oct4和Nanog表達(dá)情況均是喉癌患者預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表3 喉癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險回歸分析（n=71）

3 討論

喉癌是一種嚴(yán)重威脅患者健康的惡性疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、吞咽困難、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等癥狀。目前，喉癌發(fā)病的病因尚不清楚，通常被認(rèn)為是多種因素作用的結(jié)果，主要與吸煙、飲酒、性激素和輻射有關(guān)[3]。早發(fā)現(xiàn)、早診治對于減輕喉癌患者痛苦、提高患者生存率以及減少術(shù)后并發(fā)癥至關(guān)重要。

Oct4是POU5F1基因編碼的POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在維持干細(xì)胞正常功能中具有重要作用。有報道稱，人類表達(dá)Oct4基因的成體干細(xì)胞是癌變起源的一種靶細(xì)胞，Oct4在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[4]。湯夏冰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Oct4在喉癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，并且Oct4的表達(dá)情況與喉癌組織的分化程度有關(guān)，其可能在喉癌細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要作用，影響喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果表明，與癌旁組織相比，Oct4在喉癌組織中的陽性表達(dá)率增加，且其表達(dá)與喉癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，Oct4陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)患者，提示Oct4參與喉癌的發(fā)生發(fā)展過程，有望作為喉癌治療的新靶點和喉癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

Nanog是一種維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，在睪丸原位癌、胚胎性腫瘤以及精原細(xì)胞瘤中特異性高表達(dá)，Nanog的高表達(dá)是類干細(xì)胞全能性的侵襲前睪丸原位癌細(xì)胞的標(biāo)志。近年來，研究者們對Nanog在體細(xì)胞實體瘤中表達(dá)情況的關(guān)注度日益增加。王華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Nanog的表達(dá)升高，且其表達(dá)情況與病理分期和陰道切緣等臨床特征關(guān)系密切，可能作為預(yù)測、診斷宮頸癌及評估療效的指標(biāo)。陳麗云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與卵巢良性腫瘤組織相比，卵巢上皮癌組織中Nanog的陽性表達(dá)率明顯升高，Nanog陽性表達(dá)與卵巢上皮癌的病理分級、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)，可能在卵巢組織的惡性轉(zhuǎn)變和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Nanog在喉癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且與喉癌組織的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Nanog陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)患者，且Nanog表達(dá)情況是影響喉癌預(yù)后的獨立危險因素，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]，提示Nanog可以作為喉癌診斷和治療的新靶點。

β-catenin由一條多肽鏈組成，在細(xì)胞內(nèi)信號傳遞中扮演重要角色，其表達(dá)水平與細(xì)胞的惡性表型有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常[9-11]。本研究結(jié)果表明，β-catenin在喉癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且其表達(dá)與喉癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，β-catenin陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)患者，與相關(guān)研究結(jié)果一致[12]，提示β-catenin表達(dá)異?？赡芘c喉癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能為臨床早期診斷和評估喉癌提供參考依據(jù)。

β-catenin信號通路在生命體中廣泛存在，與動物胚胎發(fā)育、器官形成及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在疾病狀態(tài)下，機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，βcatenin信號通路中游離的β-catenin能夠進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，β-catenin與Nanog的表達(dá)呈正相關(guān)，且與患者預(yù)后不良有關(guān)，進(jìn)一步通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在A549和H23細(xì)胞表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號傳導(dǎo)時，Nanog表達(dá)和核β-catenin蛋白表達(dá)同時增加，而在β-catenin敲低的A549和H23細(xì)胞中加入表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）時，Nanog表達(dá)卻未增加，提示β-catenin能夠上調(diào)Nanog的表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌中共同發(fā)揮作用，是預(yù)后不良的重要標(biāo)志物。Yong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，幽門螺桿菌通過Wnt/β-catenin信號通路上調(diào)Nanog和Oct4的表達(dá)，當(dāng)Nanog和Oct4啟動子活性被上調(diào)后，β-catenin與這些啟動子結(jié)合，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞樣特性。Ravindran等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中，β-catenin、Oct4和Nanog的表達(dá)具有相同的變化趨勢，共免疫沉淀分析結(jié)果顯示，βcatenin與Oct4和Nanog存在相互作用，共同影響口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，喉癌組織中β-catenin、Oct4和Nanog的表達(dá)均上調(diào)，β-catenin和Oct4表達(dá)的一致性較好，βcatenin和Nanog表達(dá)的一致性較差，說明β-catenin與Oct4可能存在相互作用，而β-catenin與Nanog之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入分析，此結(jié)果與上述有關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果存在一定的差異，可能是因為樣本量和分析方法不同導(dǎo)致。

綜上所述，Oct4、Nanog和β-catenin在喉癌組織中表達(dá)異常，且與喉癌組織的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示三者可能參與了喉癌細(xì)胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，其對喉癌的作用機制可能存在部分關(guān)聯(lián)，三者聯(lián)合檢測可作為較為理想的診斷方法，對指導(dǎo)喉癌的臨床治療及判斷患者預(yù)后具有一定的應(yīng)用價值。