王建欣，羅 丹，楊謙謙，高明龍 ，楊繼章

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050031； 2. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科，河北 石家莊 050031）

精神分裂癥陰性癥狀為精神分裂癥的核心癥狀[1]。抗抑郁藥物文拉法辛聯(lián)合第2 代抗精神病藥物阿立哌唑能顯著改善精神分裂癥陰性癥狀，且安全有效。但由于抗精神病藥物治療窗相對狹窄，毒副作用較大，且精神分裂癥患者治療的依從性較差，為確保藥物治療安全有效，臨床應(yīng)用時應(yīng)監(jiān)測患者的血藥濃度，以便及時調(diào)整給藥方案。目前，國內(nèi)外測定文拉法辛和阿立哌唑血藥濃度的方法主要有高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）法[2－5]和高效液相色譜(HPLC)法[6－9]。本研究中建立了一種能同時快速、準(zhǔn)確測定精神分裂癥患者血漿中文拉法辛和阿立哌唑濃度的LC －MS／MS 法，為臨床監(jiān)測血藥濃度提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

4000Q TRAP 型質(zhì)譜儀（配有ESI 源，美國AB SCIEX公司）；HPLC －30A 型液相色譜系統(tǒng)（配有液相輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱，日本島津公司）；AnaLyst TF 1.6 軟件（美國AB SCIEX 公司）；D3024 型臺式高速微量離心機(jī)（美國賽洛捷克公司）；MX －S 型固定式混勻儀（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

試藥：鹽酸文拉法辛（成都德斯特生物技術(shù)有限公司，批號為DST190111 －025，含量不低于98%）；阿立哌唑（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號為J0215AS，含量不低于98%）；鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（惠氏制藥有限公司，批號為X44212C，規(guī)格為每粒75 mg）；阿立哌唑片（上海中西制藥有限公司，批號為180357，規(guī)格為每片10 mg）；咖啡因（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號為171215 －2010，含量為99.9%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18 ～65 歲，性別不限；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18 ～30 kg／m2；符合《國際疾病分類(第10 版)》（ICD －10）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者及法定代理人自愿參與本研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：腦器質(zhì)性疾病所致精神障礙，精神活性物質(zhì)所致精神障礙、心境障礙、神經(jīng)官能癥、精神發(fā)育遲滯診斷；合并器官功能障礙或其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病；妊娠期或哺乳期；有吸毒史；試驗前2 周內(nèi)使用過其他藥物；3 個月內(nèi)參加臨床研究；研究者認(rèn)為不適宜參與本研究。

入組情況：本試驗經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。選擇20 例精神分裂癥患者，其中男6 例，女14 例；年齡20 ～43 歲，平均（32.15±6.12）歲；體質(zhì)量55 ～64 kg，平均（59.25 ±2.67）kg；身高165 ～177 cm，平均（170.75 ±3.55）cm。

2.2 治療方案及血液樣本采集

患者口服鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（150 mg ／ d）和阿立哌唑片（10 mg ／ d），于20 d 后清晨服藥前0.5 h時，抽取肘靜脈血5 mL，置含肝素鈉的抗凝離心管中，3 000 r／min 離心10 min，分離血漿，保存在－80 ℃冰箱中，待測。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex XB－C18柱（50 mm ×3 mm，2.6 μm）；流動相：甲醇（A）－2%甲酸水溶液（B)(70 ∶30，V／ V），等度洗脫；流速：0.4 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，正離子檢測模式；離子源噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：600℃；氣簾氣（N2）壓力：20psi；霧化氣（N2）壓力：55psi；輔助氣（GS2，N2）壓力：55 psi；碰撞氣（N2）：High；毛細(xì)管：入口電壓為10 V，出口電壓為10 V。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的質(zhì)譜參數(shù)

2.4 溶液制備

對照品溶液：取文拉法辛對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的文拉法辛貯備液。用甲醇稀釋貯備液，配成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1，2，4，6，8 μg ／mL 的文拉法辛標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5，2，6 μg ／mL 的文拉法辛質(zhì)控樣品溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ“⒘⑦哌驅(qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的阿立哌唑貯備液。用甲醇稀釋貯備液，配成質(zhì)量濃度分別為0.2，0.5，1，2，4，6，8 μg／mL 的阿立哌唑標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5，3，7 μg ／mL的阿立哌唑質(zhì)控樣品溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液：取咖啡因?qū)φ掌芳s1 mg，精密稱定，置1 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質(zhì)量濃度為1 mg ／mL 的咖啡因內(nèi)標(biāo)貯備液。取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋，配成質(zhì)量濃度為1 μg／mL 的咖啡因內(nèi)標(biāo)溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血漿樣品處理

取血漿100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL、甲醇20 μL，渦旋30 s，加入甲醇270 μL，渦旋60 s，室溫下15 000 r／min離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液5 μL，進(jìn)樣分析。

2.6 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取空白血漿、空白血漿＋對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液、患者用藥1 h 后血漿樣品各6 份，按血漿樣品處理項下方法操作，得到相應(yīng)樣品色譜圖。結(jié)果顯示，文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的保留時間分別為0.58，0.67，0.64 min，血漿中內(nèi)源性成分對文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的測定無干擾，專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量下限考察：取空白血漿100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液和不同質(zhì)量濃度的文拉法辛、阿立哌唑系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各10 μL，配成文拉法辛質(zhì)量濃度分別為10，50，100，200，400，600，800 ng ／ mL，阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為20，50，100，200，400，600，800 ng／mL的系列血漿樣品溶液，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（Y）對待測物的質(zhì)量濃度（ X）進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1 ／ X2。結(jié) 果 顯 示，文 拉 法 辛 的 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 方 程 為 Y ＝4.87 ×103X ＋1.11 ×105（r ＝0.993 2）， 線 性 范 圍 為10 ～800 ng／mL，定量下限為10 ng ／mL；阿立哌唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝9.94×103X ＋1.69×105（r ＝0.992 8），線性范圍為20 ～800 ng／mL，定量下限為20 ng ／mL。

準(zhǔn)確度與精密度試驗：取空白血漿100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液和不同質(zhì)量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質(zhì)控樣品溶液各10 μL，配成文拉法辛質(zhì)量濃度分別為50，200，600 ng ／ mL 和阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng／mL 的系列血漿質(zhì)控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，連續(xù)制備3 d并測定，分別計算準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度的RSD。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間精密度的RSD 均小于15%，相對誤差為－4.67 ～7.08，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求。詳見表2。

圖1 文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因高效液相色譜圖

表2 血漿中文拉法辛和阿立哌唑的精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（n ＝6）

提取回收試驗：取不同質(zhì)量濃度（文拉法辛質(zhì)量濃度分別為50，200，600 ng／mL，阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng／mL）的血漿質(zhì)控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得相應(yīng) 峰面積（A）；同時，另取18 份100 μL 空白血漿，分成3 批，分別加入甲醇270 μL，渦旋60 s，室溫下15 000 r／min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液加入相應(yīng)濃度的文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因溶液適量，渦旋60 s，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積（B）。以A／ B 比值計算提取回收率。結(jié)果文拉法辛提取回 收 率 分 別 為（93.24 ±4.21）% ，（90.24 ±5.28）% ，（105.34 ±4.56）% ， RSD 分 別 為 4.52% ， 5.85% ，4.33%（n ＝6）；阿立哌唑提取回收率分別為（94.35 ±3.17）% ，（110.24 ±6.74）% ，（94.28 ±3.21）% ， RSD分別為3.36%，6.11%，3.40%（n ＝6）；內(nèi)標(biāo)提取回收率為（93.67 ±2.44）%，RSD 為2.60%（n ＝6），符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[10]。

基質(zhì)效應(yīng)考察：取空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得空白基質(zhì)后，加入內(nèi)標(biāo)溶液和不同質(zhì)量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質(zhì)控樣品溶液各10 μL，配成文拉法辛質(zhì)量濃度分別為50，200，600 ng／mL 和阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 的基質(zhì)考察樣品溶液各6 份，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積（C）；用純水代替血漿，加入內(nèi)標(biāo)溶液和不同質(zhì)量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質(zhì)控樣品溶液適量，配成文拉法辛質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 和阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 的質(zhì)控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品的處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得相應(yīng)峰面積（D）。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子＝C／ D ×100%。結(jié)果文拉法辛在3 個質(zhì)量濃度下的平均內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子分別為91.24% ，104.82%，107.32%（RSD ＜15%，n ＝6），阿立哌唑在3 個質(zhì)量濃度下的平均內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子分別為92.74%，102.51%，96.45%（RSD ＜15%，n ＝6），咖啡因的平均內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為104.81%（RSD ＜15%，n ＝6），提示樣品測定不受基質(zhì)效應(yīng)影響。詳見表3。

表3 基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果（n ＝6）

穩(wěn)定性考察：取不同質(zhì)量濃度（文拉法辛質(zhì)量濃度分別為50，200，600 ng／mL 和阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為50，300，700 ng／mL）的血漿質(zhì)控樣品溶液各24 份，分成4 批，分別考察在室溫放置8 h、處理后室溫放置3 d、反復(fù)凍融3 次、－40 ℃凍存1 周的穩(wěn)定性。結(jié)果血漿質(zhì)控樣品在上述條件下均穩(wěn)定，RSD 均小于15%(n ＝6)。詳見表4。

2.7 臨床應(yīng)用

20 例精神分裂癥患者文拉法辛的穩(wěn)態(tài)血藥濃度為140.62 ～483.54 ng／mL，阿立哌唑的穩(wěn)態(tài)血藥濃度為140.83 ～527.65 ng／mL。詳見表5。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（± s，n ＝6）

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（± s，n ＝6）

待測物文拉法辛阿立哌唑質(zhì)量濃度（ng ／mL）50 200 600 50 300 700室溫放置8 h 處理后室溫放置3 d 反復(fù)凍融3 次 －40 ℃凍存1 周質(zhì)量濃度（ng ／mL）48.24 ±5.27 204.51 ±23.24 612.14 ±65.40 49.17 ±5.46 291.54 ±32.14 714.59 ±74.28 RSD（%）10.92 11.36 10.68 11.10 11.02 10.39質(zhì)量濃度（ng／mL）51.24 ±5.78 201.27 ±21.08 587.34 ±62.42 48.75 ±5.27 294.34 ±28.75 704.71 ±68.54 RSD（%）11.28 10.47 10.63 10.81 9.77 9.73質(zhì)量濃度（ng ／mL）52.41 ±6.16 212.34 ±19.44 614.27 ±58.94 48.54 ±4.86 310.21 ±31.42 706.27 ±70.27 RSD（%）11.75 9.16 9.60 10.01 10.13 9.95質(zhì)量濃度（ng ／mL）48.67 ±5.48 194.66 ±18.54 607.24 ±60.27 51.24 ±5.10 308.54 ±30.96 692.47 ±68.21 RSD（%）11.26 9.52 9.93 9.95 10.03 9.85

表5 20 例精神分裂癥患者服藥后血漿中文拉法辛和阿立哌唑的血藥濃度監(jiān)測結(jié)果

3 討論

本研究中建立了能同時測定血漿中文拉法辛和阿立哌唑質(zhì)量濃度的LC －MS／MS 法，與傳統(tǒng)的HPLC 法及單一樣品檢測方法[6－7，10－11]相比，靈敏度及專屬性均有提高，且縮短了分析時間。采用甲醇沉淀蛋白法處理血漿樣品，與液－液萃取法[6－7，10]、固相萃取法[8]及乙腈沉淀蛋白[2，5]相比，提取回收率較高，操作簡便、快速，有利于節(jié)約成本。

20 例精神分裂癥患者給予臨床常規(guī)劑量文拉法辛和阿立哌唑，達(dá)穩(wěn)態(tài)時，測得文拉法辛的血藥濃度為140.62 ～483.54 ng ／mL，1 例患者高于其有效血藥濃度100 ～400 ng／mL 范圍[12]；測得阿立哌唑的血藥濃度為140.83 ～527.65 ng ／mL，1 例患者低于其有效血藥濃度150 ～500 ng／mL 范圍[13－14]，2 例患者高于該濃度范圍?？梢?，這2 種藥物在不同人群中存在一定的個體差異。文拉法辛聯(lián)合阿立哌唑治療精神分裂癥，應(yīng)監(jiān)測治療藥物血藥濃度，及時調(diào)整給藥劑量，做到個體化用藥，才能保證用藥安全有效。