王莉芳，馮正平，李曉春，張金山

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710062； 2. 西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室·藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062； 3. 中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 710062）

腎缺血再灌注導(dǎo)致腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，使細(xì)胞間的連接喪失，造成細(xì)胞凋亡、壞死而引起炎性反應(yīng)，是引起急性腎損傷的重要因素[1－2]，同時(shí)也是導(dǎo)致腎移植后功能恢復(fù)困難的主要因素，甚至可能出現(xiàn)急性腎功能衰竭，嚴(yán)重的可能導(dǎo)致死亡[3]。胃饑餓素是由28 個(gè)氨基酸組成的多肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHS－R)的內(nèi)源性配體[4]，廣泛分布于人、鼠及多種動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織器官中，如腦干、垂體、胃、腸、肝、腎等[5]。胃饑餓素與GHS－R 結(jié)合發(fā)揮作用，通過(guò)激活Ca2＋釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)Ca2＋刺激生長(zhǎng)激素(GH)的釋放[6]。本研究中選用C57 小鼠構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型，探討胃饑餓素對(duì)腎缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：成年C57 小鼠50 只，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18 ～22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（陜）2013 －001。飼料及鼠籠均購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心，大鼠飼養(yǎng)溫度為18 ～22 ℃，相對(duì)濕度為50% ～60%，自然光照。

儀器：3131 型三氣培養(yǎng)箱，1300 SERIES A2 型生物安全柜，均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；MCO－18AIC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司)；Do X6 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

試藥：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa 公司）；胃饑餓素（Sigma 公司）；白細(xì)胞介素（IL）－1β，腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL－6，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，均購(gòu)自Invitrogen 公司；缺口末端標(biāo)記（TUNEL)試劑盒(Roch 公司）；HK－2 細(xì)胞(中科院細(xì)胞所)；ERK 一抗，p－ERK 一抗，P38 兔一抗，p－P38 兔一抗，均采購(gòu)于CST 公司；GHS－R，β－actin 兔一抗及HRP 標(biāo)記兔二抗，均購(gòu)自Abcam 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備

將已適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 的C57 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A 組），模型組（B 組），胃饑餓素低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組），各10 只。A 組小鼠僅打開(kāi)腹腔，游離雙側(cè)腎，不夾閉腎蒂；B 組、C1組、C2組、C3組小鼠稱(chēng)定質(zhì)量后，腹腔注射戊巴比妥鈉0.1 g／kg 麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上，腹部備皮后酒精消毒，做長(zhǎng)約2 cm 的腹部正中切口，打開(kāi)腹腔，左、右腎脂肪囊內(nèi)游離雙側(cè)腎蒂，無(wú)創(chuàng)微血管夾夾閉，觀(guān)察腎臟顏色，由紅潤(rùn)變?yōu)榛野咨硎緤A閉有效，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，雙側(cè)腎缺血40 min 后移去血管夾，觀(guān)察腎臟顏色，出現(xiàn)紫黑至恢復(fù)紅潤(rùn)提示再灌注良好，手術(shù)線(xiàn)逐層關(guān)腹；C1組、C2組、C3組于再灌注時(shí)分別腹腔注射胃饑餓素10，20，40 μg／kg。各組小鼠在術(shù)前12 h 禁食不禁飲?；謴?fù)供血24 h 后，各組小鼠心臟采血并摘取雙側(cè)腎。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清IL－1β，IL－6，TNF－α 水平

按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取各組小鼠眼球血，每組4 只，分離血清，檢測(cè)缺血再灌注后24 h 的IL－1β，IL－6，TNF－α 水平，用多功能微孔板檢測(cè)儀（λ ＝450 nm）測(cè)定吸光度（A）。

1.2.3 腎組織過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(PAS)染色

腎組織切片，置95%乙醇中固定1 min，水洗后再將切片浸于1%過(guò)碘酸溶液中氧化5 min 后水洗，把切片放于雪夫試劑中染色5 min 后水洗，再以偏亞硫酸鈉溶液浸泡1 min 后，水洗，自然晾干，滴加1 滴香柏油，置普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.4 TUNEL 法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡

將4%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)石蠟包埋，脫蠟至水，不含DNase 蛋白酶K 消化，以鏈霉親和素（streptavidin）工作液覆蓋孵育樣品，DAPI 復(fù)染封片。200倍顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞核呈黃色為陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT －PCR）檢測(cè)腎組織中GHS－R 的表達(dá)

各組小鼠腎組織低溫研碎后用Trizol 提取其總RNA，按TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)SYBRP?remix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒步驟上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)計(jì)算2－△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡(WB)法檢測(cè)腎組織GHS－R 的表達(dá)

低溫研碎后的腎組織用RIPA 裂解液提取其總蛋白，30 μg 的蛋白樣品在10%的SDS－PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h。PVDF 膜在4 ℃溫度下與GHS－R 和β－actin 一抗孵育過(guò)夜，再用1 ∶2 000 辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體室溫下孵育1 h。最后，蛋白條帶以化學(xué)發(fā)光法顯色獲得。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析（One －way ANOVA）表示，組間比較采用Tukey′s Multiple Comparisons Test。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清IL－1 ，IL －6、TNF－ 表達(dá)水平

結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，腎缺血再灌注后，B 組中IL－1β，IL－6，TNF －α 表達(dá)水平均顯著高于A(yíng) 組（P ＜0.05）；但胃饑餓素處理組（C1組、C2組、C3組）以上3 種指標(biāo)水平均低于模型組，C2組和C3組顯著降低（P ＜0.05），降低程度與胃饑餓素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

表1 各組小鼠血清IL －1 ，IL －6，TNF － 表達(dá)水平比較（± s，pg ／mL，n ＝10）

表1 各組小鼠血清IL －1 ，IL －6，TNF － 表達(dá)水平比較（± s，pg ／mL，n ＝10）

注：與A 組比較，＃P ＜0.05；與B 組比較， P ＜0.05。

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組IL －1 16.54 ±1.68 23.30 ±1.14＃21.90 ±0.80 20.28 ±1.30 19.21 ±0.75 IL －6 286.6 ±13.22 523.5 ±45.07＃491.4 ±22.23 413.2 ±22.80 332.6 ±42.43 TNF －349.2 ±3.694 537.3 ±28.17＃516.9 ±19.03 427.3 ±32.58 378.2 ±15.97

圖1 腎組織染色結(jié)果（ ×200）

2.2 腎組織PAS 染色結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，A 組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞完整、排列整齊、胞漿豐富；B 組腎小管排列紊亂、胞漿萎縮、細(xì)胞間質(zhì)增寬，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)空泡變性，紋狀緣消失，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)明顯的腎損傷。與B 組比較，C1組、C2組和C3組的腎損傷依次明顯減弱，炎性反應(yīng)減弱，其中C2組基本接近A 組水平。

2.3 TUNEL 染色結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，A 組基本無(wú)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，B 組中腎細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，C1組、C2組和C3組腎細(xì)胞的凋亡程度下降，且有隨著胃饑餓素濃度升高而降低的趨勢(shì)。

2.4 腎組織中GHS －R mRNA 水平的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，腎缺血再灌注后，B 組腎組織中GHS－R 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著低于A(yíng) 組（P ＜0.01），C1組的GHS－R 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量與B 組相比無(wú)顯著差異，C2組和C3組有不同程度的升高，且具有顯著性（P ＜0.01），基本達(dá)到A 組表達(dá)量。

2.5 腎組織中GHS －R 蛋白水平的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，與A 組比較，B 組中GHS－R 蛋白顯著降低（P ＜0.01）；C1組、C2組、C3組的GHS－R蛋白水平表達(dá)較B 組均有不同程度升高，但C1組無(wú)顯著差異，C2組和C3組均顯著升高（P ＜0.05），與轉(zhuǎn)錄水平的趨勢(shì)具有一致性。

3 討論

圖2 腎組織中GHS －R mRNA 水平的表達(dá)

圖3 腎組織中GHS －R 蛋白水平的表達(dá)

腎臟的血流量非常豐富，具有血液代謝廢物過(guò)濾及生成尿液排出體外的功能，人雙側(cè)腎臟的血液灌注可達(dá)到1 200 mL ／min，是人體重要的器官之一。腎臟對(duì)缺血缺氧十分敏感，缺血后，腎細(xì)胞就開(kāi)始積累代謝廢物，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。血液重新灌注后，腎組織的功能不能得到立刻恢復(fù)，反而會(huì)進(jìn)一步加劇損傷[7]。缺血再灌注模型損傷的病理反應(yīng)與細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)關(guān)系密切，主要是在缺血再灌注模型過(guò)程中出現(xiàn)缺氧，導(dǎo)致氧自由基大量聚集，致使細(xì)胞DNA 斷裂，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。同時(shí)，在缺血再灌注損傷過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致大量炎性因子的釋放，引起一系列炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合相關(guān)受體，也會(huì)激活相關(guān)凋亡基因，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9－11]。

胃饑餓素在腎臟中可激活抗氧化應(yīng)激機(jī)制，保護(hù)免受血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)引起的腎臟損害[12]。RAJAN等[13]發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素可能通過(guò)迷走神經(jīng)對(duì)動(dòng)物腎缺血再灌注損傷有防護(hù)作用。TAKEDA 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃饑餓素可能通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子－1 介導(dǎo)改善內(nèi)皮功能來(lái)保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷。這也提示胃饑餓素可能通過(guò)多種途徑對(duì)腎缺血再灌注損傷起防護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，腎缺血再灌注模型損傷后，B 組炎性因子IL －1β，IL－6，TNF－α 較A 組顯著升高，且腎組織的PAS 染色結(jié)果顯示，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎組織切片結(jié)果顯示，細(xì)胞有凋亡現(xiàn)象，同時(shí)GHS－R 的基因和蛋白水平表達(dá)均顯著降低。再灌注時(shí)不同質(zhì)量濃度胃饑餓素預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)各組中IL－1β，IL －6，TNF－α 表達(dá)水平下降，腎組織的損傷減弱，且炎性癥狀消除，同時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，GHS－R 的表達(dá)量升高，且這些表現(xiàn)與胃饑餓素的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，胃饑餓素的預(yù)處理能有效減少腎缺血再灌注模型損傷后的炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡情況，減輕了腎損傷的病理性改變，且促進(jìn)GHS－R 的表達(dá)。提示胃饑餓素能減少腎缺血再灌注模型損傷后的炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)的減弱有助于腎缺血再灌注模型損傷后功能的恢復(fù)，同時(shí)炎性因子的減少可能抑制凋亡基因的激活，進(jìn)一步減少細(xì)胞的凋亡，但有待于進(jìn)一步研究。腎缺血再灌注模型損傷后胃饑餓素受體GHS－R 的表達(dá)顯著降低，胃饑餓素處理后GHS－R 的表達(dá)升高，且高劑量胃饑餓素處理后能達(dá)到缺血再灌注模型損傷前水平，提示腎缺血再灌注模型損傷后生長(zhǎng)素的減少可能是其損失加重的因素，胃饑餓素能通過(guò)增加GHS－R 的表達(dá)，兩者結(jié)合后能刺激GH 的釋放，起到對(duì)腎缺血再灌注損傷模型的保護(hù)作用。