孫新強(qiáng),陳克杰,楊一恭,王紅偉,陳迎迎,周旭燕,邵 東,徐作武

(1.浙江昌海制藥有限公司,浙江 紹興 312366;2.浙江醫(yī)藥股份有限公司 新昌制藥廠,浙江 紹興 312500)

利福霉素B(Rifamycin B)為地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)分泌的5種利福霉素組份(A,B,C,D,E)中酸性最強(qiáng)、性質(zhì)最穩(wěn)定、容易分離、最易制得的組份,可氧化成利福霉素O,并進(jìn)一步合成其他用于治療分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病、麻風(fēng)病的衍生物[1]。隨著結(jié)核病發(fā)病率的上升及利福霉素類抗生素新適應(yīng)癥的拓展,下游對原料藥的需求逐步提升。為了進(jìn)一步提升利福霉素B的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度,需深入解析菌株特性[2],進(jìn)行菌株改造[3],并運(yùn)用生化工程策略充分挖掘菌株的潛力[4-6]。Verma等[2]對地中海擬無枝酸菌S699進(jìn)行全基因組測序,有助于深層次理解菌株特性和預(yù)測相關(guān)功能。Priscila等[3]將來源于糞透明顫菌(Vitreoscillastercoraria)的血紅蛋白基因vhb表達(dá)在利福霉素B高產(chǎn)菌株中,具有vhb基因的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵搖瓶產(chǎn)量較親本提高29.5%。Bapat等[7]提出了一個結(jié)構(gòu)模型解釋了在多底物復(fù)合培養(yǎng)基中利福霉素B發(fā)酵的菌體生長和合成動力學(xué),表明葡萄糖和硫酸銨對菌株生長和產(chǎn)物形成有明顯的抑制作用。孟根水等[8]通過控制溫度、溶氧并采用流加補(bǔ)料工藝,發(fā)酵效價提高一倍以上。為了提升利福霉素B的生產(chǎn)強(qiáng)度并進(jìn)一步鞏固本司在該產(chǎn)品上的技術(shù)與成本競爭優(yōu)勢,筆者在更接近發(fā)酵罐培養(yǎng)模式的補(bǔ)料搖床上進(jìn)行培養(yǎng)基關(guān)鍵成份優(yōu)化,針對如何進(jìn)一步提升發(fā)酵中期溶氧水平提出了兩階段溫度培養(yǎng)模式,并將上述結(jié)果在10 m3中試發(fā)酵罐上進(jìn)行工藝放大,為車間商業(yè)化大生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)XC-301,保藏于浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生物藥物實驗中心。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

固體培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):酵母抽提物4.0 g/L,麥芽抽提物4.0 g/L,葡萄糖4.0 g/L,燕麥片20 g/L,瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖15 g/L,熟黃豆粉10 g/L,玉米淀粉15 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,KH2PO40.5 g/L,KNO31.0 g/L,CaCO32.0 g/L,泡敵4.0 g/L。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖120 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,熟黃豆粉10 g/L,魚粉5.0 g/L,KNO34.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO40.5 g/L,CaCO33.0 g/L,1.0 g/LCoCl2溶液1.0 g/L,泡敵0.4 g/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖500 g/L。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基消前pH值自然;所有培養(yǎng)基碳源、氮源分消,滅菌條件為121 ℃,30 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD型超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;UV-2600A型紫外可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司;BIOTECH-30JS種子罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;LiFlus SP-70L發(fā)酵罐,韓國百特倫(Biotron)公司;1 m3種子罐、10 m3發(fā)酵罐,江蘇遠(yuǎn)方迪威爾設(shè)備科技有限公司;SBA-40C型葡萄糖測定儀,山東省科學(xué)院生物研究所;BLBIO-HYG-1000型補(bǔ)料搖床,上海百侖生物科技有限公司;

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng):取-80 ℃冰箱保藏的冷凍甘油保藏液,融化后用接種環(huán)蘸取解凍液,進(jìn)行平板劃線,于溫度(30±0.5) ℃、濕度30%～60%條件下培養(yǎng)6～8 d。

種子瓶培養(yǎng):在成熟斜面上挖取5 mm×20 mm孢子接種種子培養(yǎng)基(80 mL/750 mL三角瓶),在轉(zhuǎn)速220 r/min、溫度(30±0.5) ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h。

補(bǔ)料搖床培養(yǎng):將成熟種子瓶培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)10%接發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL/1 000 mL補(bǔ)料搖瓶),在通氣量0.015 m3/h、溫度(30±0.5) ℃和轉(zhuǎn)速220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)192～216 h。

30 L種子罐培養(yǎng):取成熟種子瓶培養(yǎng)液,按體積分?jǐn)?shù)0.5%～2.5%接種子培養(yǎng)基(20 L/30 L種子罐),于溫度(30±0.2) ℃、攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min、通氣量1.8 m3/h和罐壓0.05 MPa條件下培養(yǎng)72 h。

70 L發(fā)酵罐培養(yǎng):將成熟種子罐培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)10%移發(fā)酵罐(30 L/70 L發(fā)酵罐),培養(yǎng)溫度(30±0.2) ℃,通氣量1.8～4.5 m3/h,罐壓0.05～0.1 MPa,全程用25%～28%氨水控制pH值6.4±0.02,溶氧通過攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓的共同調(diào)節(jié)維持在25%～35%。補(bǔ)料控制參考文獻(xiàn)[8]的流加補(bǔ)料,即當(dāng)葡萄糖殘留低于30 g/L時,開始補(bǔ)加50%的葡萄糖,維持葡萄糖殘留質(zhì)量濃度為10～15 g/L之間。定期取樣測定菌體體積分?jǐn)?shù)、葡萄糖殘留質(zhì)量濃度和利福霉素B效價。

1 m3種子罐培養(yǎng):取成熟種子瓶培養(yǎng)液,按體積分?jǐn)?shù)0.5%～2.5%接種子培養(yǎng)基(0.5 m3/1 m3種子罐),于溫度(30±0.2) ℃、攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min、通氣量45 m3/h和罐壓0.05 MPa條件下培養(yǎng)72 h。

10 m3發(fā)酵罐培養(yǎng):將成熟種子罐培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)10%移發(fā)酵罐(4.5 m3/10 m3發(fā)酵罐),培養(yǎng)溫度(30±0.2) ℃,通氣量225～450 m3/h,罐壓0.04～0.07 MPa,全程用25%～28%氨水控制pH值6.4±0.05。起始攪拌轉(zhuǎn)速80 r/min,當(dāng)溶氧低于25%時每次提高攪拌轉(zhuǎn)速10～20 r/min,控制溶氧在25%以上。當(dāng)葡萄糖殘留低于30 g/L時,通過質(zhì)量流量計連續(xù)補(bǔ)加50%葡萄糖,維持葡萄糖質(zhì)量濃度在10～20 g/L之間。

1.2.2 測定方法

利福霉素B效價測定:采用分光光度法測定[1]。

菌體體積分?jǐn)?shù)(PMV)檢測:參考文獻(xiàn)[8]。

氨基氮檢測:按照甲醛法測定[1]。

葡萄糖檢測:采用SBA-40C型葡萄糖測定儀檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對利福霉素B合成的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基原配方初始葡萄糖質(zhì)量濃度為120 g/L,高糖質(zhì)量濃度會影響發(fā)酵液的流變性、黏度,對溶氧傳質(zhì)和抗生素合成造成影響[7,9]。因此,在補(bǔ)料搖瓶中設(shè)置不同的初始葡萄糖質(zhì)量濃度,當(dāng)檢測葡萄糖殘留質(zhì)量濃度達(dá)到20～30 g/L時,從補(bǔ)料起始至發(fā)酵結(jié)束恒速補(bǔ)加50%葡萄糖溶液,使葡萄糖總量均為250 g/L,考察初始葡萄糖質(zhì)量濃度對利福霉素B合成的影響,實驗結(jié)果如表1所示。

表1 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對利福霉素B合成的影響Table 1 Effects of initial glucose concentration on rifamycin B synthesis

① 為初始葡萄糖質(zhì)量濃度;② 為過程補(bǔ)加質(zhì)量濃度;③ 為發(fā)酵結(jié)束時的菌體體積分?jǐn)?shù);④ 為葡萄糖殘留質(zhì)量濃度;⑤ 為利福霉素B效價。

由表1可以得出:菌體體積分?jǐn)?shù)與初始葡萄糖質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān),過高的初始葡萄糖質(zhì)量濃度會抑制菌絲分化;初始葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L時,補(bǔ)料搖瓶效價達(dá)到14 000 μg/mL以上,比140 g/L和60 g/L時效價分別高31.6%和16.0%;耗糖總量與利福霉素B效價正相關(guān)。綜合上述葡萄糖消耗質(zhì)量濃度、菌體體積分?jǐn)?shù)和利福霉素B效價這3個指標(biāo),后續(xù)研究將初始葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)整為80 g/L。

2.2 無機(jī)氮源組合對利福霉素B合成的影響

利福霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基含有豐富的無機(jī)氮源KNO3和(NH4)2SO4,硝酸鹽對地中海擬無枝酸菌具有“硝酸鹽效應(yīng)”,能增加利福霉素生物合成前體的供給和提升利福霉素合成酶基因的表達(dá)[10-11],而銨鹽能夠被菌體快速利用并促進(jìn)菌體生長。在發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)氮源總質(zhì)量濃度9 g/L保持不變條件下,考察不同KNO3和(NH4)2SO4組合對菌體生長和效價的影響,結(jié)果如表2所示。

表2 無機(jī)氮源組合對利福霉素B合成的影響Table 2 Effects of inorganic nitrogen sources ratio on rifamycin B synthesis

① 為KNO3質(zhì)量濃度;② 為(NH4)2SO4質(zhì)量濃度。

2.3 基質(zhì)質(zhì)量比對利福霉素B合成的影響

在調(diào)整初始葡萄糖質(zhì)量濃度和無機(jī)氮源組合的基礎(chǔ)上,設(shè)置各組初始葡萄糖質(zhì)量濃度均為80 g/L,以無機(jī)氮源6 g/L的KNO3和3 g/L的(NH4)2SO4,其他成份與發(fā)酵培養(yǎng)基初始配方一致的實驗組作為對照(基質(zhì)質(zhì)量比為100%),考察發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)質(zhì)量比的影響,結(jié)果如表3所示。

表3 基質(zhì)質(zhì)量比對利福霉素B合成的影響Table 3 Effects of fermentation medium concentration on rifamycin B synthesis

① 為發(fā)酵培養(yǎng)基基質(zhì)質(zhì)量比。

由表3實驗結(jié)果表明:隨著基質(zhì)質(zhì)量比的增加菌體體積分?jǐn)?shù)逐步升高,在基質(zhì)質(zhì)量比為對照組的115%時,利福霉素B效價達(dá)到(16 143±319) μg/mL,較對照(100%組)提高4.63%,繼續(xù)增加基質(zhì)質(zhì)量比到130%,效價降低。分析基質(zhì)質(zhì)量比為130%組搖瓶溶氧情況發(fā)現(xiàn):發(fā)酵中后期溶氧水平較低,可能高基質(zhì)質(zhì)量比造成菌體體積分?jǐn)?shù)過高從而引起供養(yǎng)水平下降,效價降低。

2.4 兩階段溫度控制提升利福霉素B產(chǎn)量

溶氧作為關(guān)鍵的發(fā)酵控制參數(shù),對氧依賴型目標(biāo)產(chǎn)物的合成具有決定性的影響[12],相關(guān)報道[1,3]及本司生產(chǎn)經(jīng)驗表明:維持溶氧25%以上,對于利福霉素B的合成是必需的。在生產(chǎn)實踐中,在特定的壓縮空氣系統(tǒng)和現(xiàn)有的發(fā)酵設(shè)備體系下,影響供氧水平的空氣流量、罐壓和攪拌功率是限定的,因此提高溶氧水平必須通過調(diào)節(jié)菌體的生理特點實現(xiàn)。兩階段溫度控制模式作為抗生素常用的工藝控制策略,可減緩菌絲衰老,有利于效價提高[13],特別是發(fā)酵中后期有利于提高溶氧水平。因此,在70 L發(fā)酵罐上比較了30 ℃和25 ℃恒溫培養(yǎng),生長期30 ℃中后期25 ℃培養(yǎng),對利福霉素B合成的影響(圖1)。

圖1 利福霉素B發(fā)酵恒溫和變溫培養(yǎng)攪拌及溶氧變化Fig.1 Profiles of agitation and dissolved oxygen during rifamycin B fermentation in constant temperature and temperature-variable cultivation

由圖1可以得出:地中海擬無枝酸菌在70 L發(fā)酵罐上30 ℃恒溫培養(yǎng)時,在92～155 h之間有一個溶氧低谷,此時供氧水平雖已達(dá)到最大,但仍無法滿足細(xì)胞在優(yōu)化培養(yǎng)基中對氧氣的需求。在較低溫度25 ℃培養(yǎng)時,菌體生長速率明顯降低,最高菌體體積分?jǐn)?shù)僅為42%,攪拌轉(zhuǎn)速450～480 r/min即能滿足菌體對溶氧的需求,效價僅為(18 715±292) μg/mL。采用兩階段變溫培養(yǎng)工藝,即前期培養(yǎng)溫度為30 ℃,在菌體體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%以上,特別是92～155 h間將培養(yǎng)溫度降低到25 ℃培養(yǎng),能降低低谷期菌體耗氧而彌補(bǔ)供氧不足,利福霉素B效價達(dá)到(25 849±204) μg/mL,較30 ℃恒溫時培養(yǎng)提高6.11%。相關(guān)發(fā)酵參數(shù)歸納如表4所示。

表4 恒溫和變溫培養(yǎng)對利福霉素B合成的影響Table 4 Effects of constant and temperature-variable cultivation on rifamycin B synthesis

2.5 10 m3中試罐利福霉素B發(fā)酵工藝放大

將獲得的培養(yǎng)基優(yōu)化配方和變溫培養(yǎng)工藝在10 m3發(fā)酵罐上進(jìn)行中試穩(wěn)定性試驗,實驗結(jié)果如表5所示。

表5 10 m3發(fā)酵罐利福霉素B中試工藝穩(wěn)定性驗證Table 5 Stability verification of rifamycin B fermentation in 10 m3 fermenter

由表5可以明顯得出:經(jīng)過工藝優(yōu)化后,在10 m3發(fā)酵罐上進(jìn)行5批次中試穩(wěn)定性實驗,利福霉素B效價達(dá)到(25 647.6±326.6) μg/mL,比優(yōu)化前提高了16.6%,對應(yīng)的單罐產(chǎn)量達(dá)到(189.8±3.5) kg,中試發(fā)酵水平達(dá)到70 L發(fā)酵罐規(guī)模相同的工藝水平。Elsedawy等[14]報道了遺傳改造的Amycolatopsismediterranei-RCP 1001菌株經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化,在6.6 L發(fā)酵罐上分批補(bǔ)料發(fā)酵,利福霉素B質(zhì)量濃度達(dá)到24.8 g/L。與上述報道技術(shù)比較,本司在不改變菌株的條件下,僅僅通過生化工程策略就達(dá)到同等水平,在商業(yè)生產(chǎn)中更具有優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

在更接近于發(fā)酵罐培養(yǎng)模式的補(bǔ)料搖床上研究了發(fā)酵培養(yǎng)基起始葡萄糖質(zhì)量濃度、無機(jī)氮源組合和基質(zhì)質(zhì)量比,以期獲得更適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配比與質(zhì)量濃度。由于利福霉素B發(fā)酵的關(guān)鍵之一在于溶氧保證與菌體體積分?jǐn)?shù)的辯證協(xié)調(diào),因此期望在菌體體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最大后通過降溫的方式使發(fā)酵體系攝氧率(OUR)下降,溶氧上升。在補(bǔ)料搖床上,總加糖為250 g/L時,最適初始葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L,利福霉素B效價達(dá)到(14 964±348) μg/mL;最適無機(jī)氮源組合為6 g/L的KNO3和3 g/L的(NH4)2SO4,利福霉素B效價達(dá)到(15 757±292) μg/mL;在基質(zhì)質(zhì)量比為115%時,利福霉素B發(fā)酵效價最高,達(dá)到(16 143±319) μg/mL;采用變溫培養(yǎng),即菌絲生長階段采用30 ℃,在菌體體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%以上,降溫至25 ℃,降溫不影響利福霉素B的合成且使發(fā)酵體系OUR下降,溶氧上升(92～155 h);在10 m3發(fā)酵罐上進(jìn)行穩(wěn)定性驗證,利福霉素B效價為(25 647.6±326.6) μg/mL,單罐總量達(dá)到(189.8±3.5) kg。上述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和變溫培養(yǎng)策略提高了利福霉素B發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度,有利于車間技術(shù)經(jīng)濟(jì)水平提升。