張陽(yáng)陽(yáng),姜興旭

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000)

曲酸(Kojic acid)[1],屬于弱酸性次級(jí)化合物是由真菌有氧發(fā)酵產(chǎn)生。具有抑制酪氨酸酶的能力和金屬離子的螯合作用[2],還可作為美白祛斑劑、食品防腐劑、保鮮劑和香料等[3-4],用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)具有很高的應(yīng)用價(jià)值,曲酸還可作為香料合成的中間體等[5]。在眾多曲霉屬家族中[6],米曲霉(Aspergillusoryzae)[7]占有重要的地位,人們對(duì)米曲霉的研究也越來(lái)越多,對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的研究也越來(lái)越廣泛。筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的工藝參數(shù),確定最佳工藝,為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)曲酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米曲霉Co-26;無(wú)水乙醇,葡萄糖,KCl,K2HPO4,HCl,MgSO4·7H2O,FeCl3,FeSO4(均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?;瓊脂(為生化試劑)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

立式全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(江陰濱江),高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)TL-16(湖南湘儀),紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1700(上海奧析)。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

斜面培養(yǎng)基:1.5%葡萄糖,0.2%酵母膏,2%瓊脂,pH自然,121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:10%葡萄糖,0.05% MgSO4·7H2O,2.5%酵母膏,0.05% KCl,0.1% KH2PO4,0.01% FeSO4,6%無(wú)水乙醇[8],pH 6.0,121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn):挑取斜面活化的菌體孢子,制成106CFU/mL的孢子懸液,以10%的接種體積分?jǐn)?shù)50 mL接種于250 mL搖瓶中,轉(zhuǎn)速控制在160～200 r/min。

曲酸質(zhì)量濃度[9]采用三氯化鐵比色法來(lái)測(cè)定。

1.3 單因素法

1.3.1 菌齡的影響

分別按照24,48,60,72,84,96 h的菌齡添加到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,然后分別測(cè)定曲酸的質(zhì)量濃度。

1.3.2 接種體積分?jǐn)?shù)的影響

以確定的菌齡時(shí)間為準(zhǔn),分別按照5%,10%,15%,20%,25%,30%的接種體積分?jǐn)?shù)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別測(cè)定曲酸的質(zhì)量濃度。

1.3.3 發(fā)酵溫度的影響

按照1.3.1和1.3.2的結(jié)果,分別選取23,26,29,32,34,37 ℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng),分別測(cè)定曲酸的質(zhì)量濃度。

1.3.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

按照1.3.1,1.3.2和1.3.3的結(jié)果,分別在2,3,4,5,6,7,8,9 d的天數(shù)下,分別確定曲酸的質(zhì)量濃度。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法最常用的是Box-Behnken的中心組合法[9]。運(yùn)用Design Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到最優(yōu)解,進(jìn)而確定最佳發(fā)酵條件,最后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)復(fù)證,最終確定米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)米曲霉曲酸的影響

每一組水平做3組,選取平均值,得到接種體積分?jǐn)?shù)的篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在接種體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí),曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到最大。

圖1 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)曲酸質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of inoculation volume fraction on kojic acid mass concentration

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

每一組水平做3組,選取平均值,發(fā)酵時(shí)間篩選試驗(yàn)如圖2所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí),曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到最大。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)曲酸質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of fermentation time on kojic acid mass concentration

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

每一組水平做3組,取其平均值,結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在34 ℃時(shí),曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)曲酸質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the mass concentration of kojic acid

2.1.4 菌齡的確定

菌齡每個(gè)水平做3組,取其平均值,篩選結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:菌齡為48 h時(shí),曲酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高。

圖4 菌齡對(duì)曲酸質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of bacterial age on kojic acid mass concentration

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為了更準(zhǔn)確研究各個(gè)發(fā)酵條件的交互影響作用,找出影響顯著因子,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn),設(shè)X1為體積分?jǐn)?shù),X2為發(fā)酵時(shí)間,X3為發(fā)酵溫度,X4為菌齡,Y為曲酸質(zhì)量濃度。設(shè)計(jì)四因素三水平(表1),共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),其中24個(gè)析因?qū)嶒?yàn),5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)[11],響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差回歸分析結(jié)果見(jiàn)表2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)擬合二次回歸方差分析Table 2 Response surface experiment fitting quadratic regression analysis of variance

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

方差分析表明:X3對(duì)曲酸質(zhì)量濃度影響顯著,其余三因素影響不顯著,X1和X2,X1和X4,X2和X4,X3和X4兩兩交互效應(yīng)對(duì)曲酸質(zhì)量濃度高低影響顯著,失擬項(xiàng)反映的是試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況,P=0.921 6>0.05,失擬不顯著,回歸顯著,模型選擇正確,因此可以用此模型來(lái)分析響應(yīng)值的變化[12]。

2.2.2 響應(yīng)面圖像分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用及確定最優(yōu)點(diǎn),通過(guò)Design Expert 8.0軟件來(lái)進(jìn)行可視化的分析[13-14],如圖5～7所示,分別顯示了3組以曲酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)面分析立體圖及等高線(xiàn)圖。

圖5 接種體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵時(shí)間對(duì)曲酸質(zhì)量濃度交互影響Fig.5 The inoculation volume fraction and fermentation time had interactive effects on kojic acid mass concentration

圖6 接種體積分?jǐn)?shù)與菌齡對(duì)曲酸質(zhì)量濃度交互影響Fig.6 The effect of inoculation volume fraction and bacterial age on kojic acid mass concentration was interactive

圖7 發(fā)酵時(shí)間與菌齡對(duì)曲酸質(zhì)量濃度交互影響Fig.7 Fermentation time and bacterial age had interactive effects on kojic acid mass concentration

由圖5～7可以看出:響應(yīng)者存在最大值,確定為最佳接種體積分?jǐn)?shù)10.02%,發(fā)酵時(shí)間6.23 d,發(fā)酵溫度36.47 ℃,菌齡49.49 h。最終確定為當(dāng)接種體積分?jǐn)?shù)10%,發(fā)酵時(shí)間6 d,發(fā)酵溫度36 ℃,菌齡49 h時(shí),曲酸質(zhì)量濃度最大能達(dá)到51.19 g/L。

2.2.3 模型驗(yàn)證

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,在發(fā)酵時(shí)間為6 d、發(fā)酵溫度為36 ℃、接種體積分?jǐn)?shù)10%及菌齡49 h時(shí)重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)得到曲酸的質(zhì)量濃度50.9 g/L接近預(yù)測(cè)值,說(shuō)明該模型準(zhǔn)確反映了實(shí)際發(fā)酵情況[15]。

3 結(jié) 論

通過(guò)設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化曲酸發(fā)酵工藝參數(shù),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到R2=99.91%擬合程度非常好的模型[16-17]。結(jié)果表明:采用單因素法以發(fā)酵產(chǎn)物曲酸質(zhì)量濃度為指標(biāo)依次確定接種體積分?jǐn)?shù)、最佳的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和最適合的菌齡等是發(fā)酵工藝參數(shù)的最重要的組成部分,通過(guò)響應(yīng)面對(duì)選出的因素進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù),為進(jìn)一步的發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。