林海蛟，張繼福，張 云，胡云峰

(1.中國科學院 南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；2.中國科學院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室(中國科學院 南海海洋研究所)，廣東 廣州 510301；3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州)，廣東 廣州 511458；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)屬于羧基酯水解酶，能夠逐步將甘油三脂水解成甘油和脂肪酸，并能夠催化酯化和轉酯化等重要化學反應[1-3]，在工業(yè)上應用廣泛。但是游離的脂肪酶存在著穩(wěn)定性低、對環(huán)境敏感和使用過程不能回收重復利用等諸多缺陷[4-5]。為了解決這些問題，酶的固定化技術被提出。

常見的酶固定化方法有吸附法、交聯(lián)法、包埋法和共價結合法[6]。這4種固定化方法各有其優(yōu)缺點。吸附法利用載體和酶分子之間產生的弱作用力相互吸引而聯(lián)結在一起，但是弱作用力的結合不夠牢固，在反應過程中酶分子容易脫落[7-8]。交聯(lián)法指的是利用雙功能或多功能試劑，使試劑與酶分子、酶分子之間或者試劑與載體形成共價鍵從而將酶分子固定起來[9]，交聯(lián)反應所形成的共價鍵比較穩(wěn)定，但是交聯(lián)過程又容易造成酶活力損失。包埋法是利用高分子聚合物將酶包裹起來的一種方法[10]，包埋過程對酶損害小，但該法制備的固定化酶作用力通常不強[11]。共價結合法是酶分子與載體以共價鍵結合在一起的一種方法，該法制備的固定化酶穩(wěn)定性好，但是對酶要求苛刻，容易造成酶蛋白結構改變[9]。因此，在實際應用中，經(jīng)常是多種固定化方法結合使用。比如林海蛟等[4]以硅藻土為載體，通過吸附法和交聯(lián)法聯(lián)合固定化海洋來源脂肪酶，所制備固定化酶的酶活力為124.83 U/g，酶活力回收率為67.31%；童曉倩等[12]通過包埋法和交聯(lián)法固定化風味酶，酶活力回收率為80.05%。

在吸附法和交聯(lián)法的結合應用過程中，科研人員認為交聯(lián)過程的反應較為激烈，容易造成酶活力失活[13]，因此通常選擇把交聯(lián)法放在吸附法之后，以減少交聯(lián)對酶的損害。但是吸附-交聯(lián)法降低了交聯(lián)程度，導致所制備的固定化酶在反應過程中酶分子容易脫落。目前，先交聯(lián)后吸附法固定化生物酶的相關報道較少，本實驗室[14]曾對基于無機載體硅藻土的先交聯(lián)后吸附的固定化方法進行探究，所制備固定化脂肪酶的酶活力為113.29 U/g，酶活力回收率為72.89%。該固定化酶比游離脂肪酶具有更好的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和良好的儲存穩(wěn)定性，在4 ℃保存60 d依然保持87%以上的酶活力；連續(xù)操作5次依然保持60%以上的酶活性。先交聯(lián)后吸附固定化脂肪酶的工藝研究仍值得進一步探究。

大孔吸附樹脂是一種不含交換基團、具有大孔結構的有機高聚物吸附劑，與硅藻土和蒙脫土等無機材料類似，也是利用弱作用力吸附酶分子[15]。同時，大孔吸附樹脂具有網(wǎng)狀結構和比較大的比表面積[16]，而且穩(wěn)定性好[17]。為了進一步驗證先交聯(lián)后吸附固定化法，本實驗以大孔吸附樹脂為載體進行系統(tǒng)固定化探究，通過先交聯(lián)后吸附法固定化海洋來源脂肪酶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：海洋(假絲酵母)脂肪酶(上海鼓臣生物有限公司)；大孔吸附樹脂(鄭州和成新材料科技有限公司)；聚乙烯醇PVA(天津市大茂化學試劑廠)；無水乙醇、異辛烷(天津市津東天正精細化學試劑廠)；新戊二醇二縮水甘油醚、橄欖油(上海麥克林生化科技有限公司)。

儀器：PB-10酸度計(德國Sartorus公司)；Allegra X-30R Centrifuge型離心機(Beckman公司, Coulter)；移液槍(吉爾森公司)；DJS-2012R型恒溫搖床(上海實維實驗儀器技術有限公司)；渦旋振蕩器(Tomos)；DK-8D水浴鍋、電熱鼓風箱(上海一恒科學儀器有限公司)；SCIENTZ-IID 型超聲破碎儀、超聲清洗儀(寧波新芝生物公司)。

1.2 酶活力的測定

1.2.1 脂肪酶活力的測定

酶活力的測定：游離酶的酶活力測定采用改進銅皂分光光度法[18]。固定化酶的酶活力測定方法與游離酶的測定相同，只需將游離酶換成適量的固定化酶[19]。

酶活力定義：在測定條件下(40 ℃，pH7.0)，每分鐘催化1 μmol底物轉化為脂肪酸所需的酶量為1個活力單位(U)[13]。

相對酶活力：在同一組實驗中，設定酶活力最高的一組為100%，其余組別的酶活力與之相比，用百分比表示[19]。

1.2.2 固定化酶活力回收率[19-22]

酶活力回收率的計算公式如式(1)。

(1)

1.3 脂肪酶交聯(lián)實驗[14,23]

將海洋脂肪酶溶解于pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配制成酶液濃度為2 g/mL，再將酶液4 ℃冷凍離心，取10 mL酶液上清液置于50 mL塑料管中，加入50 μL新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑，35 ℃搖床交聯(lián)2 h。

1.4 脂肪酶吸附實驗

1.4.1 載體的篩選

在交聯(lián)結束后，考察載體類型對脂肪酶吸附實驗的影響，分別稱取一定量DA-201、X-5、101D、H103、NKA-2、NKA-9、AB-8、GDX-104和HPD700等9種大孔吸附樹脂載體加入裝有酶液的塑料管中，在適當溫度的恒溫搖床里吸附一定時間，將固定化酶取出，抽濾，37 ℃烘干，測定酶活力。

1.4.2 載體量優(yōu)化

固定其他條件不變，考察載體量對脂肪酶吸附實驗的影響，分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g的HPD700大孔吸附樹脂，在適當溫度恒溫搖床中吸附一定時間，吸附結束后抽濾、烘干，測定酶活力。

1.4.3 吸附溫度優(yōu)化

固定其他條件不變，考察溫度對脂肪酶吸附實驗的影響，稱取1.0 g的HPD700大孔吸附樹脂加入塑料管中，分別放在25、30、35、40、45、50、55 ℃的搖床中吸附一定時間，吸附結束后取出抽濾、烘干，測定酶活力。

1.4.4 吸附時間優(yōu)化

固定其他條件不變，考察吸附時間對脂肪酶吸附實驗的影響，稱取1.0 g的HPD700大孔吸附樹脂加入塑料管中，分別吸附1、2、4、6、8 h后抽濾、烘干，測定酶活力。

1.4.5 吸附正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇對吸附影響較大的水平和因素，設計3水平3因素正交試驗?？疾熘笜藶橄鄬γ富盍Γ辉囼炘O計如表1。

表1 吸附正交試驗因素與水平

1.5 固定化酶的酶學性質鑒定

1.5.1 最適反應pH

將0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液配制成pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的酸堿梯度，在40 ℃搖床中測固定化酶和游離酶的酶活力。根據(jù)所測的酶活力分別繪制固定化酶和游離酶相對酶活力，比較兩者的最適反應pH。

1.5.2 pH耐受性

分別將固定化酶和游離酶放置在pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的環(huán)境中3 h，保持兩者其他處理條件一致，3 h后將固定化酶和游離酶取出，測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制兩者相對酶活力曲線，比較兩者對酸堿環(huán)境的耐受性。

1.5.3 最適反應溫度

將固定化酶和游離酶分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃的搖床中測酶活力，根據(jù)所測的酶活力分別繪制固定化酶和游離酶相對酶活力，比較兩者的最適反應溫度。

1.5.4 熱耐受性

將固定化酶和游離酶分別在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中放置3 h，保持兩者其他處理條件一致，3 h后將固定化酶和游離酶取出并測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制兩者相對酶活力曲線，比較兩者對熱的耐受性。

1.5.5 操作穩(wěn)定性

將制備好的固定化酶抽濾、烘干，稱取0.1 g，在40 ℃、pH7.0下連續(xù)反應5次，以第一次反應的酶活力為100%，探究該固定化酶的操作穩(wěn)定性。

1.5.6 儲存穩(wěn)定性

制備一定量的固定化酶并將其儲存于4 ℃冰箱，每隔一定時間取出適量，測定其酶活力，以第一次所測酶活力為100%，一直測到儲存60 d，探究固定化酶的儲存穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 吸附實驗結果

2.1.1 吸附載體的篩選

9種大孔吸附樹脂篩選結果如圖1(a)所示。結果表明：大孔吸附樹脂HPD700的吸附效果最好。HPD700是非極性大孔吸附樹脂，其比表面積650～700 m2/g、平均孔徑8.5～9.0 nm[15]。HPD700比表面積比較大，能夠吸附更多的酶分子；其平均孔徑介于其他大孔吸附樹脂之間，有可能剛好與交聯(lián)后的脂肪酶體積相匹配，既不會因為孔徑太小導致酶吸附量少，又避免孔徑過大導致吸附不牢固。本實驗優(yōu)選大孔吸附樹脂HPD700為后續(xù)固定化實驗的載體。

2.1.2 吸附載體量優(yōu)化

吸附載體量優(yōu)化結果如圖1(b)所示。結果表明：最適載體量為0.5 g，相對酶活力隨著載體量增加而降低。可能原因是在相同酶量的反應體系中，隨著載體量增加單位體積的載體所吸附的酶量變少，酶活力降低。因此選擇1.0 g作為后續(xù)載體的量。

2.1.3 吸附溫度優(yōu)化

吸附溫度優(yōu)化結果如圖1(c)所示。結果表明：隨著吸附溫度逐漸升高，相對酶活力也逐漸升高，在45 ℃時達到最高，之后隨著溫度升高相對酶活力開始下降。這可能是因為溫度逐漸升高時，酶分子的熱運動也逐漸變快[24]，吸附速度加快，吸附量增加；但是過高的溫度會使酶分子從載體上脫落，甚至使酶蛋白質變性。所以當溫度升高到45 ℃之后，酶活力下降。因此選擇45 ℃作為后續(xù)實驗溫度。

2.1.4 吸附時間優(yōu)化

吸附時間優(yōu)化結果如圖1(d)所示。結果表明：在吸附1 h時相對酶活力達到最高，之后隨吸附時間延長酶活力下降?？赡茉蚴窃谖? h后，大孔吸附樹脂HPD700已經(jīng)吸附酶分子飽和，之后隨著吸附繼續(xù)進行，載體孔隙堵塞，造成酶促反應時酶分子不能充分展開。

注：1.平行實驗個數(shù)為3，所得數(shù)據(jù)為3個平行實驗均值，誤差計算方法是計算3個平行實驗的標準差。

2.1.5 吸附正交試驗結果

吸附正交試驗結果如表2所示。對正交試驗結果進行方差分析，5%顯著水平，溫度FA=9.025，載體量FB=12.172，時間FC=1.406，三者都小于Ftab=19.000，因此3個因素對相對酶活力影響都不顯著。依據(jù)極差分析結果，主次影響因素由大到小依次為：載體量、溫度、時間，最適吸附條件為：溫度40 ℃、載體量1.0 g、時間2 h，在該條件下所測酶活力為190.80 U/g，酶活力回收率為43.04%。

表2 吸附正交試驗結果與分析

2.2 酶學性質鑒定結果

2.2.1 最適反應pH

固定化酶和游離酶最適反應pH結果如圖2(a)所示。結果表明：在pH5.0～8.5，固定化酶與游離酶的相對酶活力變化趨勢基本一致，最適反應pH都是8.0。但是在pH 5.0時固定化酶的相對酶活力比游離酶高。

2.2.2 pH耐受性

固定化酶和游離酶pH耐受性結果如圖2(b)所示。結果表明：在pH5～6和pH8～9下放置3 h，固定化酶的穩(wěn)定性比游離酶略低；但是在pH7.0，固定化酶的酶活明顯高于游離酶。這可能是因為大孔吸附樹脂HPD700具有較大的比表面積，酶分子被吸附后在酸和堿環(huán)境中暴露的面積也比游離酶大，因此更容易受到外界pH影響；但是在pH7.0，固定化酶明顯比游離酶具有更好的pH耐受性。

2.2.3 最適反應溫度

固定化酶和游離酶的最適反應溫度如圖2(c)所示。結果表明：游離酶最適反應溫度為45 ℃，固定化酶的最適反應溫度為60 ℃，比游離酶提高15 ℃。由此可見，本實驗制備的固定化酶比游離酶最適反應溫度大幅度提高。

2.2.4 熱耐受性

固定化酶和游離酶的熱耐受性結果如圖2(d)所示。結果表明：在30～40 ℃，固定化酶的相對酶活力低于游離酶，但固定化酶在50～70 ℃，溫度穩(wěn)定性明顯高于游離酶。這可能是因為游離酶暴露在高于50 ℃的高溫條件下，酶蛋白結構受熱發(fā)生改變；而固定化酶在固定化載體的保護下一定程度上減弱高溫環(huán)境的損害，因此溫度穩(wěn)定性比游離酶好。而且，游離酶在溫度超過60 ℃后，酶活力急劇下降，在70 ℃時只剩余25.60%，而固定化酶在70 ℃時還能保留約60%的酶活力。因此進一步說明固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。

2.2.5 操作穩(wěn)定性

固定化酶的操作穩(wěn)定性結果如圖2(e)所示。結果表明：固定化脂肪酶連續(xù)反應操作5次后仍保留57.38%的酶活力，相比于游離酶只能操作1次，固定化酶的操作穩(wěn)定性比游離酶大幅度提高。

2.2.6 儲存穩(wěn)定性

固定化脂肪酶儲存穩(wěn)定性結果如圖2(f)所示。結果表明：隨著保存時間延長酶活力慢慢下降，在第14天時剩余77.82%的酶活力，第60天剩余69.40%酶活力。且從第5天到第60天，固定化酶的酶活力基本保持不變，可見該方法所制備固定化酶儲存穩(wěn)定性較好。

注：1.平行實驗個數(shù)為3，所得數(shù)據(jù)為3個平行實驗均值。誤差計算方法是計算3個平行實驗的標準差。

3 討論

本研究是為了進一步驗證先交聯(lián)后吸附法固定化脂肪酶的可行性和適用性。本實驗室之前以無機材料硅藻土為載體，使用先交聯(lián)后吸附法制備固定化脂肪酶的酶活力為113.29 U/g，酶活力回收率為72.89%[14]。對比先前的實驗，本工作以有機材料大孔吸附樹脂HPD700為載體，通過先交聯(lián)后吸附法制備的固定化酶的酶活力為190.80 U/g，酶活力回收率為43.04%。雖然酶活力回收率沒有之前結果高，但是固定化酶的酶活力比之前提高了68.41%?？梢?，利用先交聯(lián)后吸附法固定化脂肪酶工藝的效果較好并具有可行性。

目前對于先交聯(lián)后吸附法固定化脂肪酶的研究比較少，大多數(shù)以先吸附后交聯(lián)法為主。比如：姜峻穎等[25]采用MI-BSI伯胺功能基吸附樹脂載體和京尼平交聯(lián)劑，通過吸附-交聯(lián)法固定化海洋脂肪酶YS2071；趙康等[26]以樹脂為載體，京尼平為交聯(lián)劑，采用吸附-交聯(lián)法制備了固定化脂肪酶；Cao等[27]利用聚乙烯亞胺(PEI)制備的磁性微球載體吸附脂肪酶，再以戊二醛作為交聯(lián)劑進一步將被微球吸附的脂肪酶與PEI交聯(lián)，從而制備固定化脂肪酶。以上這些研究都是采取吸附-交聯(lián)的固定化方法，但是先吸附后交聯(lián)法降低了交聯(lián)程度，所制備的固定化酶在反應過程中酶分子容易脫落。本實驗使用的先交聯(lián)后吸附法固定化脂肪酶，所得固定化結果要優(yōu)于先前的一些先吸附后交聯(lián)固定化方法。比如：本實驗室以硅藻土為載體，先吸附后交聯(lián)固定化海洋來源脂肪酶，所制備固定化酶的酶活力124.83 U/g[4]；錢明華等[17, 28]以大孔吸附樹脂HPD 750為載體，所制備固定化酶的酶活回收率32.16%，低于本研究的43.04%。由此可見，先交聯(lián)后吸附法可以作為一種可行的固定化方法進行工業(yè)酶的固定化，在工業(yè)酶的固定化制劑研究中具有較好的開發(fā)前景。

4 結論

本研究采用先交聯(lián)后吸附法固定化海洋來源脂肪酶。交聯(lián)實驗以新型雙環(huán)氧試劑新戊二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑，在本實驗室之前優(yōu)化的最優(yōu)條件(交聯(lián)pH5.5，溫度35 ℃，質量分數(shù)0.5%，時間2 h)[14]下進行，交聯(lián)結束后加入篩選得到的大孔吸附樹脂HPD700進行吸附優(yōu)化實驗。通過單因素試驗和正交試驗確定了最佳吸附固定化條件為：溫度40 ℃、載體量1.0 g、吸附時間2 h。在此工藝條件下所制備固定化脂肪酶的酶活力為190.80 U/g，酶活力回收率為43.04%。

對游離酶和所制備的固定化酶進行酶學性質鑒定，固定化酶和游離酶的最適反應pH都是8.0，但pH5.0～6.0時固定化酶的酶活力比游離酶高。在固定化酶的pH耐受性實驗中，發(fā)現(xiàn)固定化酶在pH6.0～8.0的穩(wěn)定性比游離酶好，在pH7.0時固定化酶的酶活明顯高于游離酶。固定化酶的最適反應溫度為60 ℃，比游離酶最適反應溫度提高15 ℃。熱耐受性實驗顯示游離酶放置在溫度越高的環(huán)境中酶活力下降越快，特別是在溫度超過60 ℃后酶活力急劇下降，在70 ℃時僅剩下25.60%酶活力；而固定化酶對熱環(huán)境的耐受性很好，在30～50 ℃的環(huán)境酶活力不下降反而上升，在50～70 ℃，熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶，在溫度超過60 ℃后酶活力下降緩慢，70 ℃時依然剩余59.66%酶活力。固定化酶的操作穩(wěn)定性顯示，所制備的固定化酶連續(xù)操作5次后剩余57.38%酶活力，操作穩(wěn)定性得到很大提升。固定化酶的儲存穩(wěn)定性實驗顯示，在4 ℃冰箱保存60 d時剩余69.40%酶活力，可見該方法制備的固定化酶具有較好的儲存穩(wěn)定性。