胡姜麗，徐 蕾，許藝蘭，劉晶潔，孫 悅，謝炎東，賓石玉,2*

(1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541006)

鱖Sinipercachuatsi是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，主要以小魚、蝦及昆蟲等為食，廣泛分布于水庫、江河和湖泊，其肉營養(yǎng)豐富，味道鮮美，市場價格高，需求量大[1-3]。近年來我國人工養(yǎng)殖鱖魚正呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢，其胚胎的成活率直接影響到鱖魚養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益[4]。

卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)ST)是從哺乳動物卵泡液中分離出的一種單鏈糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一的一種結(jié)合抑制蛋白，對促卵泡素(FSH)具有較強的抑制作用，能與TGF-β超基因家族其他成員相互作用，廣泛參與了生物體多種生理功能的調(diào)控，包括繁殖、生長發(fā)育、神經(jīng)誘導(dǎo)、滲透壓調(diào)節(jié)、肌細胞生成和免疫調(diào)節(jié)[5-7]。研究表明，斑馬魚在整個胚胎發(fā)育過程都有 FST表達[8]，金鯛Sparusaurata在各組織的表達水平不同，在眼和心組織的FST表達量很低[9]。成體鯰魚Silurusasotus和牙鲆Paralichthysolivaceus的肝臟與肌肉組織中不表達FST基因[9-11]，大黃魚Larimichthyscrocea胚胎發(fā)育的原腸胚期之前FST基因微量表達，在肌節(jié)生成期和孵化后的第30天表達量達到高峰[12]。當前有關(guān)鱖FST基因在不同發(fā)育時期胚胎發(fā)育表達的研究尚未見報道。本文采用RT-PCR技術(shù)克隆鱖FST基因cDNA全序列，采用生物信息學方法分析其cDNA序列結(jié)構(gòu)特征，以及氨基酸同源和進化關(guān)系，并對FST在鱖不同胚胎時期的表達變化進行分析。本文研究結(jié)果可為鱖的生物學提供新的信息，而FST在不同胚胎發(fā)育過程中差異表達分析結(jié)果可為開展鱖的人工繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

1.1.1 實驗材料

實驗用鱖魚來源于桂林漓江和湖南省水產(chǎn)研究所鱖魚原種場。人工繁殖和胚胎發(fā)育實驗操作參考文獻[13-14]的方法：在鱖的受精期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、體節(jié)出現(xiàn)期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟搏動期、血液循環(huán)期和仔魚期分別采樣，樣品用液氮快速冷凍處理后，存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.1.2 試劑

主要試劑從大連寶生物集團有限公司采購，包括細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、TaKaRa LA Taq? 和pMD19-T載體試劑盒(TAKARA)、瓊脂糖、丙烯酰胺、Taq DNA 聚合酶及mRNA提取試劑盒等。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

分別取鱖的受精期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、體節(jié)出現(xiàn)期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟搏動期、血液循環(huán)期和仔魚期樣品50～100 mg：首先用mRNA試劑盒提取總RNA，其次通過1%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 15 min)和分光光度計測定其完整性和濃度，然后使用mRNA純化試劑盒(TAKARA)分離純化得到富含poly(A)的mRNA，最后以mRNA作為模板，采用Super Script?Ⅱ-RT逆轉(zhuǎn)錄酶和poly(T)引物合成單鏈cDNA。實驗步驟和方法按照說明書操作進行。

1.2.2 FST基因的克隆

根據(jù)本實驗室測得的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得FST部分基因序列，從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下載其他魚類的FST基因全序列，用DNAStar 比對進行保守性分析。用Primer 5.0軟件在其保守性較高的區(qū)域設(shè)計FST基因3′端、5′端克隆引物及其通用引物，引物序列詳見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 FST基因克隆引物

以cDNA為模板進行RACE法克隆[15-17]。所擴增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析其純度，具體實驗步驟參考徐蕾等[14]的方法。測序結(jié)果經(jīng)模板比對以及網(wǎng)上NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中BLAST，確定為目的基因片段后，使用DNAstar軟件進行序列拼接得到FST基因全序列。

1.2.3 FST基因的生物信息學分析

對克隆得到的FST序列進行核苷酸序列分析及氨基酸推導(dǎo)應(yīng)用DNAMAN。FST基因蛋白質(zhì)的氨基酸組成、等電點及理論分子量計算應(yīng)用ProtParam在線工具推測。通過PROSITE在線軟件進行蛋白質(zhì)的功能區(qū)預(yù)測。在NCBI上用OFR Finder程序?qū)Λ@得的cDNA序列進行開放閱讀框檢測，同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中將該序列與已登陸的其他物種的FST進行BLAST初步比較分析，用Clustal W軟件進行氨基酸多序列比對，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 引物設(shè)計和實時熒光定量PCR

根據(jù)克隆出來的ORF 區(qū)序列，用Primer 5.0軟件進行FST基因的熒光定量引物設(shè)計；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，選取鱖管家基因β-actin為內(nèi)參基因(見表2)。采用SYBR GreenⅠ染料法，在熒光定量儀(Bio-Rad公司，CFX 96 touch型號)上進行擴增和數(shù)據(jù)分析。以最小Ct值和最高熒光值為標準，分別對循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進行優(yōu)化。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL SYBR?Premix Ex Taq TM，1 μL引物，2 μL cDNA模板，ddH2O補充至總體積。熒光定量反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s變性，58 ℃ 30 s退火，PCR循環(huán)40個，最后72 ℃ 15 s延伸。繪制溶解曲線：65～95 ℃，每0.05 ℃讀板1次；反應(yīng)結(jié)束后觀察實驗結(jié)果并進行數(shù)據(jù)處理。

表2 熒光定量引物

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR后，根據(jù)數(shù)據(jù)處理收集到的目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，目的基因的相對表達量計算運用2-ΔΔCt方法，其中ΔΔCt=((Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組)。所有結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

采用SPSS 20.0 軟件對所得表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較，并用SigmaPlot 12.0軟件對處理完成的數(shù)據(jù)做鱖FST基因的相對表達折線圖。P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FST基因cDNA氨基酸序列分析

cDNA氨基酸序列測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的氨基酸序列進行比對，該序列含有1 271 bp：開放閱讀框(ORF)區(qū)為960 bp，5′端非編碼區(qū)(5′UTR)為81 bp，3′端非編碼區(qū)(3′UTR)為230 bp；編碼319個氨基酸殘基，蛋白相對分子質(zhì)量為35.38 kD，等電點為8.45(見圖1)。

陰影部分表示kazal-類絲氨酸蛋白酶抑制域，下劃線部分表示TGF-β結(jié)合結(jié)構(gòu)域，黑框部分表示FST基因核苷酸序列的起始密碼子和終止密碼子

2.2 氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將鱖FST基因的氨基酸序列和從NCBI網(wǎng)站找到的其他20個物種FST基因的氨基酸序列進行比對，結(jié)果見表3。氨基酸同源性比較發(fā)現(xiàn)：鱖FST編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列相似性很高，有很高的同源性；與哺乳動物相比，鱖與其他魚類FST編碼的氨基酸序列相似性較高。

表3 鱖FST基因與其他物種編碼的蛋白氨基酸同源性比較

用MEGA 5.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹見圖2。由圖2可知，鱖與金鯛首先成簇，再與大黃魚和牙鲆成簇，表明：鱖與金鯛氨基酸序列相似性為98 %，親緣關(guān)系最近；與大黃魚氨基酸序列相似性為97 %，親緣關(guān)系較近。鱖FST基因的系統(tǒng)進化樹中，魚類簇較近，哺乳動物簇較近，說明該進化樹關(guān)系是正確的。

圖2 鱖FST基因與其他脊椎動物FST基因成員的進化樹

2.3 FST基因的熒光定量表達分析

以鱖的β-actin為內(nèi)參基因，采用qPCR方法檢測FST基因在鱖的不同胚胎發(fā)育時期的表達，數(shù)據(jù)處理后結(jié)果表明：在11個不同胚胎發(fā)育時期中，鱖FST基因都能檢測到表達，詳見圖3。圖3中，在受精期和卵裂期FST低表達；從卵裂期開始，表達開始逐漸明顯增加；在神經(jīng)胚期達到最高表達；之后，表達急速下降；從體節(jié)出現(xiàn)期到仔魚期，表達小幅度波動，均很少；從血液循環(huán)期開始，表達有小幅增加。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=5)；1～11分別為受精期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、體節(jié)出現(xiàn)期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟搏動期、血液循環(huán)期和仔魚期11個不同的發(fā)育時期；圖上的不同字母表示差異的顯著性(P<0.05)

3 討論

卵泡抑素(FST)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員中的一種結(jié)合抑制蛋白，對促卵泡素(FSH)具有較強的抑制作用，能與TGF-β超基因家族其他成員相互作用，同時，還在胚胎發(fā)育、肌肉生長和疾病控制方面具有重要的生物學功能[18]。目前，在人Homosapiens、大黃魚Larimichthyscrocea、羅非魚Oreochromismossambicus、斑馬魚Daniorerio、草魚Ctenopharyngodonidella等已有報道，而鱖魚卵泡抑素的相關(guān)報道還未見。

本文研究采用RACE和常規(guī)PCR技術(shù)克隆得到鱖FST基因的全長序列為1 271 bp，包括ORF區(qū)960 bp、5′端81 bp、3′端230 bp，總共編碼319個氨基酸。采用MEGA 5.0建立FST系統(tǒng)進化樹模型，將該序列與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中查找的其他物種氨基酸序列進行了比較分析，獲得的結(jié)果表明：鱖FST編碼的氨基酸序列與其他物種的序列相似性很高，具有很高的同源性；FST的氨基酸序列在不同種屬間高度保守。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，鱖與金鯛親緣關(guān)系最近，其次是與大黃魚和牙鲆。進化樹中魚類簇較近，哺乳動物簇較近，這與其分類學的進化分析結(jié)果一致。在動物活體內(nèi)，F(xiàn)ollistatin存在多種分子形式，變化范圍在31～42 kD。在高等動物中，F(xiàn)ollistatin基因前體蛋白包含信號肽、N-端結(jié)構(gòu)域、Follistatin結(jié)構(gòu)域l、Follistatin結(jié)構(gòu)域2、Follistatin結(jié)構(gòu)域3和C-端結(jié)構(gòu)域共6個結(jié)構(gòu)域[19]。在鱖FST蛋白結(jié)構(gòu)域中，半胱氨酸殘基高度保守。與其他物種FST蛋白進行比對結(jié)果顯示，這幾個半胱氨酸殘基具有非常高的保守性，表明它們在對FST蛋白發(fā)揮其生物學功能中有著重要的作用。

近年來人工養(yǎng)殖鱖魚發(fā)展迅速，其胚胎的成活率直接關(guān)系到養(yǎng)殖經(jīng)濟效益[4]。彭中友等[20]發(fā)現(xiàn)FST可以影響豬胚胎早期的發(fā)育能力。本實驗選擇了11個不同胚胎時期的樣本作為研究對象，研究FST基因在鱖不同胚胎發(fā)育時期的表達規(guī)律，并進行qPCR定量分析，結(jié)果表明：在11個不同胚胎發(fā)育時期中，鱖FST基因都能檢測到表達，與FST在大黃魚不同胚胎發(fā)育時期的表達相符，但具體的相對量有差異。在受精期和卵裂期，F(xiàn)ST的表達很低；在神經(jīng)胚期達到最高表達；之后，表達急速下降；從體節(jié)出現(xiàn)期到仔魚期，表達小幅度波動，均很少；從血液循環(huán)期開始，表達小幅增加。在大量研究FST的實驗中，更多是研究FST對胚胎早期的神經(jīng)誘導(dǎo)作用，并發(fā)現(xiàn)FST對骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)具有抑制作用[21]。我們推測FST基因在鱖胚胎發(fā)育的原腸胚期和神經(jīng)胚期可能促進神經(jīng)的發(fā)育。本文研究獲得的鱖FST基因序列和生物信息學分析的同源進化特征以及發(fā)育時序表達等，將有助于更深一步研究鱖FST的表達機制，并為鱖的人工繁殖和養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。