王 利，劉 寧，周 斌，洪康進，臧毅鵬，王夢夢，聶光軍

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由谷氨酸單體通過α-氨基與γ-羧基形成γ-酰胺鍵而聚合成的氨基酸均聚物，熔點為223.5 ℃，熱分解溫度為253.9 ℃，具有可食性、吸水性與保水性、可生物降解、無毒和環(huán)境友好等特性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境和護膚品等領(lǐng)域[1-4]。目前，困擾γ-PGA開發(fā)應(yīng)用的主要問題之一是分離純化[3]，其分離純化成本與發(fā)酵液的復(fù)雜程度有著密切的聯(lián)系。液體發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的主要問題有：發(fā)酵液黏度較高，發(fā)酵液傳質(zhì)擴散慢和溶氧量低下；液體發(fā)酵液成分復(fù)雜，副產(chǎn)物積累多，導(dǎo)致γ-PGA純化成本高[5]。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的常用基質(zhì)大多為農(nóng)業(yè)固體廢棄物，如稻殼、農(nóng)林業(yè)秸稈和下腳料等，這在一定程度上降低了生產(chǎn)成本，但因其可溶物的溶出作用導(dǎo)致發(fā)酵液顏色加深和副產(chǎn)物增加，從而導(dǎo)致γ-PGA的分離純化成本也相應(yīng)提高[6]?；诙栊怨腆w基質(zhì)的發(fā)酵，增加菌絲體與營養(yǎng)介質(zhì)接觸的比表面積，增加通氣量，提升γ-PGA產(chǎn)量，不僅可以有效避免液體發(fā)酵的諸多不足，而且可以最大程度降低發(fā)酵基質(zhì)組分的復(fù)雜程度，提升γ-PGA的分離純化效率。

γ-PGA分離純化的主要內(nèi)容包括除菌、除蛋白和色素。高黏發(fā)酵液常用的除菌方法主要有高速離心法、絮凝法和微孔濾膜法[7-8]，高速離心法需要多次離心，處理量??；絮凝法成本高；由于γ-PGA分子量大小與微濾膜孔徑相近，所以微孔濾膜法不易分離。除蛋白和色素的方法主要有有機溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法和膜分離法[9-10]。在單純應(yīng)用有機溶劑沉淀和化學(xué)沉淀分離γ-PGA時，隨著發(fā)酵液組分復(fù)雜性的增加，分離步驟會增加，所用的有機試劑的量相應(yīng)增加，分離成本隨之增加。而膜分離中，膜成本高，易堵塞，分離效率低下。目前，發(fā)酵液的分離純化方法不針對于液態(tài)發(fā)酵液或固體發(fā)酵物，因固態(tài)發(fā)酵只需加入生理鹽水，震蕩后過濾去除固體基質(zhì)，即可按液態(tài)發(fā)酵液分離純化。Wang[11]等通過稀釋發(fā)酵液除細胞，活性炭脫色和超濾，脫色88%，γ-PGA產(chǎn)量為35 g/L。但活性炭脫色時間短，脫色效率低；脫色時間長會導(dǎo)致難以與γ-PGA分離。喬長晟[12]等通過板框法除菌，酶解法除大分子多糖，活性炭法脫色，超濾法除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥得γ-PGA成品，γ-PGA純度達90%。效果較好但流程復(fù)雜，成本較高，耗時長。Yuan[13]等用銅離子從發(fā)酵液中回收γ-PGA，后經(jīng)EDTA螯合銅離子，透析，冷凍干燥得γ-PGA，回收率達90%以上。操作相對簡便，但用銅離子會造成污染，而EDTA價格昂貴，增加成本。為此，建立一種高效的分離純化方法對γ-PGA開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。

選擇珍珠巖作為惰性基質(zhì)進行固體發(fā)酵，因其化學(xué)穩(wěn)定性好，不參與反應(yīng)，且可重復(fù)使用，可增大發(fā)酵基質(zhì)的利用效率和發(fā)酵過程中氧傳遞效率，有效提高γ-PGA的產(chǎn)量，降低其發(fā)酵液中雜質(zhì)的含量；再組合應(yīng)用醇沉、透析和萃取等方法，建立了一種綜合性純化策略。此法統(tǒng)籌考慮了生產(chǎn)與分離，簡化了發(fā)酵液的預(yù)處理，降低了有機試劑的使用量，一定程度上降低了γ-PGA分離純化的成本，為γ-PGA的規(guī)模化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆菌(Bacillus Subtilis Natto)從市售納豆菌粉中分離篩選所得；乙醇、丙酮(分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠)；氯仿(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；商用γ-PGA(四川拙誠日化科技有限公司)。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0；斜面培養(yǎng)基：成分同種子培養(yǎng)基，加瓊脂條20 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0；初始固體發(fā)酵培養(yǎng)基：用3倍體積蒸餾水浸泡洗凈的大豆12 h，蒸熟時間為30 min，后碾碎分裝，蓋上三層紗布，121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

(1)培養(yǎng)方法。

①種子培養(yǎng)。從斜面取一環(huán)菌種接于種子培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，震蕩培養(yǎng)16 h，菌濃約為3×107個/mL(OD600 nm=6)。

②固體惰性基質(zhì)選擇。首先研究惰性載體對γ-PGA顏色的影響。30 g大豆浸泡、蒸煮后碾磨，分別與3 g稻殼和10 g分子篩(無固體介質(zhì)為對照)混勻滅菌，接種量3 mL(10%)菌液，于37 ℃培養(yǎng)36 h，放置4℃冰箱后熟36 h。其次是惰性載體的選擇。以完全碾碎的大豆為營養(yǎng)基質(zhì)，按質(zhì)量比1∶1添加不同類型的惰性載體(稻殼、分子篩、泡沫、硅膠珠和珍珠巖)，在初始pH 7.0，接種量5%，37 ℃的條件下培養(yǎng)36 h，放置4 ℃冰箱后熟36 h。

③發(fā)酵液的預(yù)處理。用兩倍體積的生理鹽水溶解固體發(fā)酵基質(zhì)，溶液200 r/min震蕩1 h，用4層紗布過濾，獲得浸提液；再將濾渣以同樣方式處理，獲得二次浸提液。將浸提液混合后10 000 r/min離心15 min，取上清液，放置于4 ℃冰箱備用。用4倍體積的蒸餾水稀釋上清液，充分混勻后，10 000 r/min離心15 min，取上清液；用3倍體積的冰乙醇與上清液充分混勻，4 ℃冰箱中靜置12 h后，10 000 r/min離心15 min，取沉淀，60 ℃烘干至恒重。

(2)γ-PGA的提取。

①丙酮沉降。用0.1 g γ-PGA粗品配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。分別向其中加入1～5倍體積的丙酮，充分混勻后，4 ℃冰箱靜置12 h，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，60 ℃烘干至恒重，測量其提取率與純度。

②電驅(qū)透析。由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的γ-PGA分子量一般在100～1 000 kD之間[14]，故選用截留分子量在8～12 kD的透析袋透析丙酮沉降后的γ-PGA樣品，以去除色素與小分子蛋白。由于γ-PGA和蛋白所帶電性的差異，在透析袋的兩端加上100 伏特的電壓，透析時間分別為0～30 h，取透析液測量其純度。

③苯酚處理。用0.1 g透析處理的γ-PGA樣品配制2 mg/mL溶液。量取10 mL溶液，依次添加10 mL苯酚、10 mL氯仿和1 mL異戊醇，混勻后于30 ℃、120 r/min 震蕩30 min，靜置分層后，取上清，加入3倍體積乙醇沉降12 h，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，60 ℃烘干至恒重，測量其純度。

(3)測定方法。

①紫外-可見光譜分析。將不同處理的樣品配制200 pg/mL后，應(yīng)用北京普析TU-1810PC紫外可見分光光度計進行紫外掃描。

②茚三酮比色法[15]測定γ-PGA純度。高溫完全水解γ-PGA為谷氨酸后，測定顯色液在570 nm的OD值，計算水解后谷氨酸的含量，進一步檢測γ-PGA的純度。谷氨酸標準曲線為：

Y=0.001X+0.047(R2=0.996)。

γ-PGA純度計算如下所示：

式中，G為通過標準曲線計算的谷氨酸含量(ug)；W為樣品水解前的質(zhì)量(ug)。

③HPLC含量測定。用0.05 M Na2HPO4溶液配制同濃度的樣品，經(jīng)0.45 um膜過濾，應(yīng)用TOSOH TSK-GEL G6000PWXL色譜柱(日本島津LC-2030高效液相色譜儀)，流動相為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.0)，流速為0.5 mL/min，在216 nm檢測樣品。

④紙層析法[15]測定γ-PGA的單體組成。將0.2 g γ-PGA樣品用10 mL 6 mo1/L的鹽酸110 ℃，水解17 h。調(diào)溶液pH至7.0，定容至100 mL，過濾后垂直點樣3次。平衡反應(yīng)空間15 min后，在展層劑(正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶20)中層析，烘干后用0.1%茚三酮-丙酮溶液顯色。

⑤SDS-PAGE電泳[16]測定γ-PGA的分子量。配制6%的分離膠與5%的濃縮膠，點樣后用80 V低壓進行濃縮，至分離膠左右調(diào)至100 V電泳。將凝膠浸入考馬斯亮藍染色液染色0.5 h，脫色后用阿利新藍染8-GX染液復(fù)染，脫色至條帶清晰。

2 結(jié)果與討論

2.1 惰性基質(zhì)的篩選

以稻殼和分子篩為固體基質(zhì)(大豆為對照)時，γ-PGA粗品的顏色變化顯著，具體如圖1所示。由圖1可知，根據(jù)固體基質(zhì)類型的不同，γ-PGA粗品的顏色深淺變化：稻殼>大豆>分子篩。這可能由于蒸煮過程中大豆和稻殼中的色素和可溶物溶出，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品顏色變深，增加產(chǎn)物分離純化的難度。分子篩作為固體支持基質(zhì)時，γ-PGA粗品的顏色最淺，表明惰性載體一定程度上降低了發(fā)酵組分的復(fù)雜性，有利于后續(xù)產(chǎn)品的純化。進一步研究不同惰性載體對γ-PGA產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，固體支持物都能顯著增加γ-PGA產(chǎn)量，其中珍珠巖對γ-PGA產(chǎn)量提升影響最大，達到了60g/Kgds(Dry Substance, DS)，是對照的兩倍。這是由于固體支持物增加了菌體的表面積，有利于傳質(zhì)擴散，增加通氣量，促進微生物的增殖與代謝。但是，過大或過小尺寸的固體基質(zhì)都不利于微生物發(fā)酵。珍珠巖可能因為粒徑適中，既利于菌體分散，又不阻礙物質(zhì)傳輸，進而促進了γ-PGA的生產(chǎn)。更重要的是，珍珠巖在提升γ-PGA產(chǎn)量的同時，γ-PGA粗品的顏色也較淺(見圖5a)，其純度達到了72.62%，有效降低了γ-PGA分離純化的成本。

圖1 惰性基質(zhì)對γ-PGA粗品顏色的影響

圖2 不同惰性支持介質(zhì)對γ-PGA產(chǎn)量的影響

2.2 γ-PGA的分離純化

(1)丙酮處理。分析丙酮用量對γ-PGA的提取效率的影響。丙酮和透析對γ-PGA分離純化的影響如圖3所示。由圖3a可知，γ-PGA的提取率隨著丙酮添加量的增加而增加，當丙酮添加量為3倍體積(150 mL)時，γ-PGA提取率達到70.2%；繼續(xù)增加丙酮用量，提取率增加不顯著。為了減少有機溶劑使用量，丙酮使用比例確定為3倍體積。經(jīng)過丙酮處理后，γ-PGA樣品色澤變淺(見圖5b)。不同處理的γ-PGA樣品的紫外光譜圖如圖4所示。由圖4可知，γ-PGA在210 nm處的特征吸收峰的峰面積比處理前的增大了。同時，260～280 nm區(qū)間內(nèi)雜蛋白的吸收峰的峰面積變小，表明丙酮處理后的γ-PGA純度有所提升，純度測定顯示丙酮處理后的γ-PGA樣品純度增加至80.2%，純度提升10.4%。由于色素和蛋白易溶于丙酮，丙酮脫色效果較明顯。且γ-PGA不溶于丙酮，故丙酮可以達到純化γ-PGA的效果[17]。

(2)透析。透析不僅可以除去粗品中的小分子色素及雜質(zhì)，還可以除去上一步丙酮純化后殘留的丙酮。由圖3b可知，隨著透析時間的增加，γ-PGA樣品純度逐漸增加，透析18 h后，樣品顏色進一步變白(見圖5c)，樣品純度達到83.6%。表明透析過程中，小分子色素及蛋白不斷滲出。由圖4可以看出，經(jīng)過透析處理后，γ-PGA透析樣品的最大特征峰值及其峰面積都高于未處理對照。但是，雜蛋白所形成的吸收峰的峰面積也變大，可能是γ-PGA樣品中隨著小分子色澤及雜質(zhì)的去除，導(dǎo)致截留下來的大分子蛋白濃度的相對提升。

圖3 丙酮和透析對γ-PGA分離純化的影響

(3)苯酚處理。因蛋白具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，故應(yīng)用苯酚去除透析所截留下來的大分子蛋白雜質(zhì)。由圖4可知，經(jīng)過苯酚處理后，γ-PGA的特征吸收峰值及其面積進一步增大，非常接近γ-PGA標品的峰形；同時，260～280 nm處的雜蛋白吸收峰進一步降低，表明苯酚處理進一步提升了γ-PGA的純度。純度測定顯示γ-PGA樣品的純度升高至89.12%，樣品呈白色粉末狀(見圖5d)。由于γ-PGA是谷氨酸高聚物，其結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)存在基團差異。故基于DNA提取過程中[18]利用苯酚與蛋白分子相似相溶的原理，實現(xiàn)除去大分子雜蛋白的目的。此外，應(yīng)用氯仿除去水相中的殘留少量酚，加速有機相與水相分層，有利于γ-PGA的分離。

圖4 不同處理的γ-PGA樣品的紫外光譜圖

圖5 不同處理后γ-PGA樣品的色澤變化

2.3 γ-PGA樣品的鑒定

SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)γ-PGA粗品的條帶較寬且有拖尾與前泳現(xiàn)象，表明粗品含有一定雜質(zhì)，且分子量不是很均一(見圖6)；但是，其核心位置與純化后樣品的條帶位置一致，說明粗品的純度相對較高，表明以惰性固體基質(zhì)發(fā)酵的γ-PGA粗品的雜質(zhì)含量較低。純化后的γ-PGA樣品條帶位置與γ-PGA的標品和商用品的基本一致，且樣品帶寬更窄，表明基于固體惰性基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA的分子量約為700kD，且分子量比較均一，說明分離純化的效率高。進一步應(yīng)用紙層析分析γ-PGA的水解液，不同γ-PGA樣品及其水解液的紙層析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，γ-PGA樣品的水解液與γ-PGA標品的水解液和谷氨酸標品溶液的展層形貌完全一致，說明樣品水解液中只含有谷氨酸，表明其純度較高。進一步比較發(fā)現(xiàn)，γ-PGA標準品、γ-PGA樣品未出現(xiàn)層析斑點，而γ-PGA粗品呈現(xiàn)放射狀層析斑點，一方面說明γ-PGA粗品中含有雜蛋白和其他氨基酸，需要進一步純化；另一方面說明γ-PGA粗品經(jīng)純化后不含其他雜質(zhì)，表明分離純化效率較高。

圖6 不同γ-PGA樣品的SDS-PAGE圖7 不同γ-PGA樣品及其水解液的紙層析

應(yīng)用HPLC分析純化后的γ-PGA樣品與γ-PGA標準品，分析結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，兩者的HPLC圖譜非常接近(Rt均為8 min)，且與Zeng[19]報道一致，表明純化后的γ-PGA樣品質(zhì)量很接近γ-PGA標準品。

圖8 γ-PGA樣品與標品的HPLC圖譜

3 結(jié)論

綜上，基于惰性基質(zhì)固體發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA不僅產(chǎn)量提升了兩倍，而且雜質(zhì)含量少，便于后續(xù)分離純化。這為統(tǒng)籌考慮γ-PGA生產(chǎn)與分離純化，提出綜合γ-PGA制備的策略提供了契機。進一步地，組合多種分離純化方法，將γ-PGA粗品的純度提升至89.12%，其分子量均一，樣品質(zhì)量接近γ-PGA標品。表明上述制備策略不僅效率高，而且節(jié)省了發(fā)酵液預(yù)處理的時間和有機溶劑的使用量，為γ-PGA分離純化方面的研究提供有益參考。