董 樂 何靜艷 鄭婷婷 戴聰杰 黃衛(wèi)紅 李元躍

(1. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000；2. 泉州師范學(xué)院福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000；3. 泉州師范學(xué)院近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 泉州 362000；4. 集美大學(xué)福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 集美 361000)

本課題組前期從非洲大蝸牛消化道中分離出一種混合酶，酶自身無抗氧化能力，但EPS經(jīng)其酶解后產(chǎn)物的抗氧化能力顯著提高。本研究擬以該混合酶為酶制劑，以羥自由基(·OH)清除率為綜合評價(jià)指標(biāo)，對EPS的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并評價(jià)EPS粗品酶解前后的抗氧化活性，以期為EPS在功能性食品和藥品方面的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

紫球藻藻種：中國科學(xué)院海洋研究所藻種庫；

非洲大蝸牛消化道中制備的混合酶：1 874.52 U/g，泉州師范學(xué)院福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

臺式高速離心機(jī)：Allegra 64R型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-6D型，金壇市城東宏業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1200型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FDU-2110型，上海紀(jì)革森實(shí)業(yè)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：W2-100S型，上海申生科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EPS粗品的提取 取紫球藻的KOCH培養(yǎng)液，4 000 r/min 離心20 min，留上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(45 ℃)，加入3倍體積無水乙醇醇析過夜，4 000 r/min離心10 min，收集醇析物，真空冷凍干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS粗品。

1.2.2 酶解液的制備工藝 取一定量EPS粗品配成水溶液，依次調(diào)節(jié)酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值、酶添加量(酶/底物)、保溫酶解(不斷調(diào)節(jié)pH 值，使酶解過程在初始pH 值下進(jìn)行)一定時(shí)間后，沸水浴滅酶活10 min，10 000 r/min 離心10 min，得酶解液。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 通過預(yù)試驗(yàn)確定酶解EPS粗品單因素試驗(yàn)的基本條件為：酶解溫度65 ℃、酶解時(shí)間6 h、酶解pH值7.0以及酶添加量(酶/底物，E/S)2.8 U/mg。通過固定其他條件只改變其中一個(gè)條件來分析各單因素對酶解產(chǎn)物清除·OH能力的影響[14]。

(1) 酶解溫度：酶解溫度分別選取25，35，40，45，55，60，65，70，75 ℃，在酶解時(shí)間6 h，酶解pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg 的條件下，測定EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率。

(2) 酶解時(shí)間：在酶解溫度65 ℃，pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg的條件下，分別酶解2，3，4，5，6，7 h，測定EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率。

(3) 酶解pH值：酶解pH分別選用4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間6 h，酶添加量2.8 U/mg的條件下，測定EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率。

(4) 酶添加量：酶添加量分別選用0.1，0.7，1.4，2.0，2.8 U/mg，在酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間6 h，pH值8.0的條件下，測定EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15-16]，以·OH清除率為響應(yīng)值，確定中心點(diǎn)試驗(yàn)是自變量取值為試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平中值，非中心點(diǎn)試驗(yàn)為其他取值，重復(fù)5次中心點(diǎn)試驗(yàn)，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

1.2.5 EPS粗品酶解產(chǎn)物的制備 以響應(yīng)面最佳優(yōu)化參數(shù)酶解EPS粗品得酶解液，10 000 r/min離心5 min，Sevage法除蛋白[17-18]后，4 000 r/min離心10 min，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(45 ℃)，加入3倍體積無水乙醇醇析過夜，4 000 r/min離心10 min，收集醇析物，真空冷凍干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS酶解產(chǎn)物。

1.2.6 EPS粗品酶解前后抗氧化活性的測定

(1) ·OH清除能力：參考文獻(xiàn)[14]。

(2) DPPH·清除能力：參考文獻(xiàn)[19]。

(3) ABTS+·清除能力：參考文獻(xiàn)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同平均值之間的差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中的鄧肯氏多重比較法進(jìn)行。顯著差異水平P<0.05，極顯著差異水平P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度 由圖1可知， EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率隨酶解溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解溫度升至65 ℃時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率達(dá)到最大值。酶解過程中，酶催化反應(yīng)的速度和酶的穩(wěn)定性會(huì)受到溫度的影響。隨著溫度的升高，反應(yīng)速度會(huì)加快，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶失活以及變性，從而影響反應(yīng)速度。因此，最佳酶解溫度選取65 ℃。

圖1 酶解溫度對EPS粗品酶解產(chǎn)物·OH清除 能力的影響

Figure 1 Effect of enzymolysis temperature on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.2 酶解時(shí)間 由圖2可知， EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率隨酶解時(shí)間的延長先增大后減小，在6 h時(shí)達(dá)到最大值。酶解時(shí)間大于6 h后，由于大部分EPS粗品已被酶解，且酶活力逐漸下降，酶解產(chǎn)物不再隨時(shí)間的延長而增加，酶解產(chǎn)物對·OH的清除率開始下降。因此，酶解時(shí)間選取6 h為宜。

圖2 酶解時(shí)間對EPS粗品酶解產(chǎn)物·OH清除 能力的影響

Figure 2 Effect of enzymolysis time on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.3 酶解pH 由圖3可知，酶解體系中pH對酶解效果有顯著的影響。當(dāng)酶解pH在4.0～8.0時(shí)，隨pH的升高EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率急劇增大，pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值，隨后快速下降。這是因?yàn)椴煌拿笇?yīng)不同的最適pH，過酸過堿都會(huì)使酶失活。所以酶解pH選擇8.0。

圖3 酶解pH對EPS粗品酶解產(chǎn)物·OH清除 能力的影響

Figure 3 Effect of enzymolysis pH on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.4 酶添加量 由圖4可知，EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率隨酶添加量的增加逐漸增加，可能是酶量的增加而可提高其水解能力，從而使酶解產(chǎn)物中對·OH清除活性強(qiáng)的組分增加。但考慮到試驗(yàn)條件的可控制性和重現(xiàn)性，酶添加量選擇2.8 U/mg為佳。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對EPS粗品酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。

利用軟件Design-Expert 8.0.6對試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行多元回歸擬合，得數(shù)學(xué)回歸模型：

圖4 酶添加量對EPS粗品酶解產(chǎn)物·OH清除 能力的影響

Figure 4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors, levels and codingTable of Box-Behnken design test

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D+0.78AB-2.92AC+1.73AD-3.48BC+1.02BD+0.36CD-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(1)

對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表 3。

由表3可知，該模型P值<0.000 1，表明模型是極顯著的，而且失擬項(xiàng)P值為0.154 2，表明失擬項(xiàng)不顯著，該模型穩(wěn)定。由表3中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，A、B和D對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率影響極顯著(P<0.01)，C對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率影響顯著(P<0.05)；AC和BC對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率影響均顯著(P<0.05)，A2對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率影響顯著(P<0.05)，B2、C2和D2對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率影響極顯著(P<0.01)。

將不顯著項(xiàng)從回歸方程中剔除，進(jìn)行二次方差分析，結(jié)果見表 4。結(jié)果表明，回歸方程中各項(xiàng)均達(dá)顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)?；貧w方程為：

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D-2.92AC-3.48BC-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(2)

響應(yīng)面中的等高圖能夠直觀地反映出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，酶解溫度和酶解pH、酶解時(shí)間和酶解pH之間交互作用的等高線圖和響應(yīng)面見圖5、6。

酶解溫度和酶解pH對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率的影響近似橢圓形，說明有交互作用[圖5(b)]。由圖5(a)可知，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH清除率隨pH的增加呈先增加后減小的趨勢，在pH為7.0～7.8 時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率較高，在pH一定時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH清除率隨酶解溫度的變化較小，當(dāng)酶解溫度為65 ℃左右時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率較高。

酶解時(shí)間和酶解pH對EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率的影響近似橢圓形，說明有交互作用[圖6(b)]。由圖6(a)可知，當(dāng)酶解pH一定時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率隨時(shí)間的延長呈先增加后減小的趨勢，在酶解時(shí)間達(dá)6 h時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率較高，在酶解時(shí)間一定時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率隨pH的增加有較小幅度的變動(dòng)，在酶解pH 7.0～7.8時(shí)，EPS粗品酶解產(chǎn)物的·OH清除率高。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)和方差分析?Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極其顯著，P<0.01；R2=0.959 3，Adj.R2=0.918 6。

表4 二次方差分析?Table 4 Quadratic analysis of variance

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極其顯著，P<0.01；R2=0.949 7，Adj.R2=0.921 8。

圖5 酶解溫度和酶解pH對·OH清除率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Figure 5 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis temperature and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

圖6 酶解時(shí)間和酶解pH對·OH清除率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Figure 6 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis time and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件計(jì)算出的最優(yōu)工藝條件：酶解溫度63 ℃、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，酶解時(shí)間6.3 h。按該條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測定EPS粗品酶解產(chǎn)物對·OH的清除率為(70.64±0.38)%，理論預(yù)測值為67.78%，兩者非常接近，表明模型預(yù)測值與實(shí)際值的誤差在允許范圍之內(nèi)。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的EPS粗品酶解工藝條件參數(shù)是可信的。

2.4 EPS粗品酶解前后的抗氧化活性

3 結(jié)論

本研究以從非洲大蝸牛消化道中分離的混合酶為酶制劑，通過響應(yīng)面法建立EPS粗品酶解制備抗氧化酶解物工藝的二次多項(xiàng)回歸方程，通過方差分析，模型顯著，所得方程擬合度高。試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)酶解工藝條件為：酶解溫度63 ℃、酶解時(shí)間6.3 h、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，在此條件下EPS酶解產(chǎn)物的·OH清除率為(70.64±0.38)%。

表5 EPS粗品酶解產(chǎn)物對自由基的清除效果Table 5 Effects of the enzymolysis EPS on radical scavenging