房雷雷 趙肖通 張彥青 解軍波

(1. 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2. 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，天津 300134)

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種新型生物信息傳遞分子，可由單核巨噬細(xì)胞RAW264.7等產(chǎn)生，在免疫、循環(huán)、呼吸、神經(jīng)等系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，已成為當(dāng)代生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)[1]。試驗證明，真菌多糖具有較強(qiáng)的免疫活性，且大多數(shù)真菌多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2-4]，其中重要途徑之一是促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫活性物質(zhì)(如NO等)[5-7]。

姬松茸(Agaricusbrasiliensis)別名巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，為現(xiàn)今世界上可人工栽培的珍稀藥食兼用菌之一[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)姬松茸對免疫系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用，對非特異性免疫、特異性免疫和細(xì)胞免疫體系均有增強(qiáng)作用。在姬松茸的免疫調(diào)節(jié)作用中，姬松茸的多糖成分為主要活性成分，且大量文獻(xiàn)[9-10]證明姬松茸多糖能在多條途徑和多個層面顯示免疫活性。

姬松茸多糖免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究大多集中于具體表征而非探究其機(jī)制，且多以小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7建立細(xì)胞模型，一些研究結(jié)果已經(jīng)表明姬松茸多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增值、釋放NO和分泌腫瘤壞死因子(Tumor nerosis factor-α, TNF-α)、γ-干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)、白細(xì)胞介素1(Interleukin-1-β, IL-1β)與白細(xì)胞介素8(Interleukin-8, IL-8)等[11-13]。本試驗擬建立小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞模型，分析姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞NO釋放與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表達(dá)的影響，同時研究其對NF-κB抑制蛋白(IκBα)磷酸化水平的影響，從姬松茸多糖影響NF-κB信號傳導(dǎo)途徑的角度出發(fā)，深入探討姬松茸多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的機(jī)制，以期為開發(fā)姬松茸多糖提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸多糖樣品：多糖含量為99%，實驗室自制；

脂多糖( Lipopolysaccharides, LPS)：美國Sigma公司；

全蛋白提取試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；

DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素：美國Gibco公司；

山羊p-IκBα抗體：美國Santa Cruz公司；

BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

兔iNOS、(HRP)-共軛抗山羊二抗抗體：美國Thermo公司；

兔β-actin抗體、抗兔二抗抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：BP211D型，德國Sartoriμs公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司；

多功能酶標(biāo)儀：SpectraMax?M3型，美國Molecular Devices公司。

1.3 溶液配制

DMEM完全培養(yǎng)液：分別向DMEM培養(yǎng)基中加入終濃度為10%和1%的胎牛血清和青鏈霉素雙抗，保存于4 ℃冰箱中；

亞硝酸鈉溶液：稱取適量亞硝酸鈉，并用DMEM完全培養(yǎng)液溶解，溶解完全后配制成終濃度為1 mmol/L亞硝酸鈉儲備液，并稀釋成5，10，25，50，75，100 μmol/L，于4 ℃冷藏備用；

Griess溶液：稱取適量Griess試劑并溶于250 mL蒸餾水中，配制成濃度為40 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，放置于4 ℃冰箱避光保存；

LPS溶液配制：稱取LPS脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末，加入DMEM完全培養(yǎng)液溶解，溶解后混勻，得到終濃度為1 μg/mL 的LPS溶液，過濾除菌，冷藏備用；

姬松茸多糖溶液配制：精密稱取姬松茸多糖樣品10 mg，將樣品置于10 mL的容量瓶中，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋并定容，制得1 mg/mL的姬松茸多糖儲備液，配制成不同濃度溶液(6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)，過濾后冷藏。

1.4 方法

1.4.1 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng) 培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)液，細(xì)胞放置于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，通入5% CO2中培養(yǎng)(相對濕度90%)。細(xì)胞每隔1～2 d傳代一次，試驗接種細(xì)胞為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4.2 RAW264.7細(xì)胞釋放NO的測定 運(yùn)用Griess試劑測定NO的釋放量，研究姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞NO釋放作用的影響。

(1) NO標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取75 μL不同濃度(0，5，10，25，50，75，100 μmol/L)的亞硝酸鈉置于96孔板，每孔再加入75 μL Griess溶液，混勻后靜置3 min后，采用酶標(biāo)儀檢測540 nm處吸光度。

(2) 將培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞懸液(5×105個/mL)以每孔100 μL接種于96孔板，并培養(yǎng)24 h。然后，用姬松茸多糖樣品處理2組細(xì)胞：一組是將細(xì)胞在1 μg/mL LPS和姬松茸多糖溶液(濃度分別為0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)下培養(yǎng)24 h；一組是將25 μg/mL的姬松茸多糖溶液加入細(xì)胞后分別培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，16，24，30，36 h。而后，吸取75 μL上清液于新96孔板中，并添加 Griess溶液、混勻、靜置，而后測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到NO濃度。

1.4.3 RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)的測定 收集已加入0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL姬松茸多糖溶液培養(yǎng)24 h的巨噬細(xì)胞，采用全蛋白提取試劑盒提取RAW264.7細(xì)胞全蛋白，并選用BCA試劑盒檢測其蛋白含量。蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot，WB)[14]測定iNOS的表達(dá)量(β-actin為參比蛋白)，而后采用凝膠成像系統(tǒng)處理膠片，并運(yùn)用Quantity One軟件分析試驗結(jié)果。WB試驗選用抗體為：兔iNOS、兔β-actin抗體、抗兔二抗抗體。

1.4.4 RAW264.7細(xì)胞p-IκBα蛋白表達(dá)的測定 采用WB法測定，姬松茸多糖濃度為25 μg/mL，姬松茸多糖作用巨噬細(xì)胞時間為0，15，30，45，60 min，所選用抗體為山羊p-IκBα抗體與(HRP)-共軛抗山羊二抗抗體，其他試驗步驟同1.4.3。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理 上述所有試驗均重復(fù)6次，數(shù)據(jù)用“平均值±SD”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS軟件，并選用單因素方差分析(ANOVA)中LSD最小顯著差法檢驗組間差異性。所有圖像采用Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO

采用Griess法對巨噬細(xì)胞NO釋放量進(jìn)行檢測，并以各濃度亞硝酸鈉為底物，利用Griess試劑測定吸光度值，得NO標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.018x+0.010(R2=0.999)。

通過亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到各組NO濃度，結(jié)果見圖1。由圖1(a)可知，25 μg/mL姬松茸多糖作用RAW264.7細(xì)胞36 h內(nèi)，NO濃度隨作用時間的延長而逐漸增加，具有較強(qiáng)的時效性。圖1(b)表明，與空白對照組相比，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL姬松茸多糖作用24 h后， RAW264.7細(xì)胞NO釋放量極顯著增大(P<0.01)，且作用效果隨劑量的增大而增強(qiáng)。以姬松茸多糖濃度為x值，以NO濃度為y值進(jìn)行線性分析，得到回歸方程為y=0.130 2x+2.35，判定系數(shù)R2為0.736 6，表明姬松茸多糖對NO釋放的影響具有一定程度的線性關(guān)系。綜上表明，姬松茸多糖能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO，且具有一定的時效性和劑量依賴性。

研究[15]表明，NO的釋放是巨噬細(xì)胞的非特異性免疫——一種重要的機(jī)體防御過程的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)受到如腫瘤細(xì)胞、病原體及微生物等刺激時，巨噬細(xì)胞被活化并產(chǎn)生一系列的效應(yīng)分子，NO便是其中之一。一方面，NO被作為巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的重要信使分子，通過細(xì)胞間信息交換載體功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；另一方面，NO對巨噬細(xì)胞吞噬的各類腫瘤細(xì)胞與微生物等具有細(xì)胞毒性[16]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO等多種因子參與免疫反應(yīng)[17]。本試驗結(jié)果顯示姬松茸多糖作用后能夠顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO，與相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]報道姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞NO生成的試驗結(jié)果相一致，說明姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞的免疫活性有正向的促進(jìn)作用?？梢?，姬松茸多糖能夠通過增加巨噬細(xì)胞NO的釋放而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

圖1 姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞釋放NO作用的影響

Figure 1 The effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on NO production in RAW264.7 cells

2.2 姬松茸多糖對RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)水平的影響

iNOS催化L-精氨酸生成NO，是哺乳動物體內(nèi)NO合成的唯一途徑[18]，故本研究選用Western Blot法進(jìn)一步檢測姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)量的影響，以β-actin為內(nèi)參蛋白。由圖2可知，與空白對照組相比，不同濃度姬松茸多糖(0.00，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL)作用24 h后，能夠明顯增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平(P<0.01)。線性分析得回歸方程為y=0.106 4x+3.052 3，判定系數(shù)R2=0.649 1，證明不同濃度姬松茸多糖作用后，對RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)水平的影響有一定的劑量依賴性。說明姬松茸多糖能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成iNOS，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

此外，iNOS表達(dá)量與NO釋放量的量效關(guān)系呈現(xiàn)一致的趨勢，進(jìn)一步驗證了姬松茸多糖能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)iNOS蛋白進(jìn)而大量釋放NO。

Figure 2 The effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on iNOS protein expression in RAW264.7 cells

2.3 姬松茸多糖對RAW264.7細(xì)胞IκBα蛋白磷酸化水平的影響

NF-κB具有多項調(diào)節(jié)作用，是iNOS基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的調(diào)控因子，靜息狀態(tài)下保持P50-P65-IκB三聚物的形式。當(dāng)收到活化信號后，IκB的絲氨酸殘基被磷酸化，并從NF-κB解離進(jìn)入胞核，起到活化轉(zhuǎn)錄因子的效用[18]。而后，P50-P65二聚體與κB基序結(jié)合，表現(xiàn)出一系列重要生物學(xué)、病理學(xué)活性[19]。

如圖3所示，25 μg/mL的姬松茸多糖處理RAW264.7細(xì)胞不同時間(0，15，30，45，60 min)后，p-IκBα蛋白的含量隨處理時間的延長而增加，45 min時達(dá)到最高，表明姬松茸多糖可以引起IκBα蛋白磷酸化水平的升高，表示姬松茸多糖能夠誘導(dǎo)IκBα蛋白的磷酸化，從而證明姬松茸多糖能夠激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

圖3 姬松茸多糖對RAW264.7細(xì)胞IκBα蛋白磷酸化 水平的影響

Figure 3 Effects ofAgaricusbrasiliensispolysaccharide on phosphorylation of IκBα protein in RAW264.7 cells

研究[20]表明，iNOS蛋白的表達(dá)、NO的釋放與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)，NF-κB/IκB途徑在其中起重要作用，故由試驗結(jié)果可推測姬松茸多糖能夠通過激活巨噬細(xì)胞NF-κB通路誘導(dǎo)其合成iNOS從而促進(jìn)釋放NO。

3 結(jié)論

本試驗以巨噬細(xì)胞釋放NO的行為變化為靶點(diǎn)，檢測姬松茸多糖的免疫調(diào)節(jié)作用并探究其機(jī)制。試驗結(jié)果顯示，姬松茸多糖作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，可通過激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)iNOS蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NO釋放，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，作用效果顯著且具有良好的時效和量效性。本文選用了NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探究姬松茸多糖對巨噬細(xì)胞的NO釋放作用的影響機(jī)制，在后續(xù)的研究中，將對多糖的免疫活性及其他相關(guān)信號通路與機(jī)理等做進(jìn)一步深入的探索。