楊 萍 涂宗財(cái),3 劉 俊 邵艷紅 謝雅雯 沙小梅 張 露

(1. 江西師范大學(xué)功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022；2. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330022；3. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)屬于溶菌酶家族，結(jié)構(gòu)呈球形，其單體由123個(gè)氨基酸組成，分子量約為14.2 kDa。α-LA是乳清蛋白中唯一能結(jié)合鈣離子的蛋白，且4個(gè)天冬氨酸殘基均能結(jié)合鈣離子，其獨(dú)特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)賦予α-LA突出的功能特性和生物學(xué)活性，使其在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。在臨床領(lǐng)域，α-LA 具有抗氧化、降血壓、抗癌、降血脂、抗病毒、抗菌、螯合金屬等作用[2]。

目前，許多改性方法如輻照[3]、美拉德[4]、熱處理[5]等，用于提高α-LA的功能性質(zhì)。而動(dòng)態(tài)高壓微射流(Dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種集高速碰撞、高頻振蕩、瞬時(shí)壓力降、強(qiáng)剪切、氣穴作用和超高壓作用為一體的新興高壓加工技術(shù)，被廣泛用于生物大分子的改性[6]。研究發(fā)現(xiàn)DHPM預(yù)處理能誘導(dǎo)牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)，提高BSA的美拉德反應(yīng)程度[7]。此外美拉德反應(yīng)是一種蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羧基之間的化學(xué)反應(yīng)，能改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，如卵清蛋白經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后，其乳化性、起泡性得到顯著改善[8]。然而，對(duì)DHPM結(jié)合美拉德反應(yīng)改性α-LA的研究較少。

本研究擬以α-LA為研究對(duì)象，采用DHPM結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA進(jìn)行復(fù)合改性，研究改性后的結(jié)構(gòu)、乳化特性和抗氧化活性，為拓寬α-LA在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛乳α-LA：L-6010，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

乳糖、鄰苯二甲醛(OPA)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇：分析純，索萊寶試劑有限公司；

大豆油：市售；

碘化鉀、甲醇：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

硼砂：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

乳糖：分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：U-3200型，日本日立公司；

熒光分光光度計(jì)：F-7000型，日本日立公司；

納米超高壓均質(zhì)機(jī)：NCJJ-0.007/200型，廊坊通用機(jī)械有限公司；

圓二色譜儀：MOS 450型，法國(guó)Bio-Logic公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

旋渦混合儀：WH-866型，上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：SynergyH1型，美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 稱取一定質(zhì)量的α-LA，溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制成濃度為1 mg/mL的溶液。經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)處理，均質(zhì)壓力分別為0，80，110，140 MPa，常溫下處理3次，收集溶液，取其中一部分溶液加入等質(zhì)量的乳糖，混勻，分裝凍干，分別記為L(zhǎng)A-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac、LA-140-Lac，余下溶液不加糖，分別記N-LA、LA-80、LA-110、LA-140，分裝凍干冷藏備用。將凍干后的樣品置于培養(yǎng)箱中，在55 ℃，相對(duì)濕度65%的條件下反應(yīng)8 h，反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于冰浴中終止反應(yīng)。4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SDS-PAGE 根據(jù)文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 接枝度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]。用相同的方法，以賴氨酸代替樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，游離氨基含量為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.287x+0.007。

1.2.4 內(nèi)源熒光性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]。

1.2.5 表面疏水性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]。

1.2.6 圓二色譜分析 根據(jù)文獻(xiàn)[11]。

1.2.7 乳化性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[13]。

1.2.8 ABTS+·清除能力 根據(jù)文獻(xiàn)[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)均重復(fù)3次，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE

圖1為DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德改性對(duì)α-LA分子量的影響。由圖1可知，α-LA的分子量在14.4 kDa左右，與N-LA相比，LA-80、LA-110和LA-140的電泳條帶均無(wú)明顯變化。α-LA與乳糖混合樣品的條帶均上移，說(shuō)明α-LA與乳糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，分子量增加；然而，LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac條帶之間沒(méi)有顯著差別。此外所有的樣品在31 kDa附近出現(xiàn)明顯條帶，這是因?yàn)棣?LA 在美拉德反應(yīng)過(guò)程中分子之間發(fā)生了聚合，形成了二聚體[15]。

M. Marker蛋白 1. N-LA 2. LA-80 3. LA-110 4. LA-1405. LA-0-Lac 6. LA-80-Lac 7. LA-110-Lac 8. LA-140-Lac圖1 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德改性前后α-LA的 SDS-PAGE電泳圖

Figure 1 SDS-PAGE ofα-LA treated by DHPM pretreatment combined with Maillard reaction

2.2 接枝度的測(cè)定

游離氨基含量能夠用來(lái)評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)的程度[16]，并以接枝度的形式表示。如圖2所示，LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的接枝度均大于LA-0-Lac，且隨著處理壓力的增大，樣品的接枝度顯著增加(P<0.05)。表明DHPM預(yù)處理能夠促進(jìn)美拉德反應(yīng)，原因是高壓作用改變了α-LA的空間構(gòu)象，暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn)，提高了美拉德反應(yīng)程度[7]。當(dāng)壓力達(dá)到110 MPa時(shí)，LA-110-Lac的接枝度達(dá)到最大，說(shuō)明美拉德反應(yīng)程度達(dá)到最大。但當(dāng)處理壓力大于110 MPa 時(shí)，LA-140-Lac的接枝度顯著降低(P<0.05)，可能是過(guò)大的壓力作用使α-LA空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且美拉德反應(yīng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)的聚合反應(yīng)，掩蓋了部分反應(yīng)基團(tuán)[17]，降低其接枝度。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA接枝度的影響

Figure 2 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the degree of grafting ofα-LA

2.3 內(nèi)源性熒光測(cè)定

內(nèi)源性熒光是檢測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)常用的方法。圖3為不同處理壓力結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA內(nèi)源性熒光的影響。經(jīng)DHPM處理后，α-LA的熒光強(qiáng)度先升高后降低。這是因?yàn)镈HPM的高速碰撞、高頻振蕩、強(qiáng)剪切、氣穴作用等，破壞了α-LA的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致隱藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的Trp更多地暴露在極性環(huán)境中，從而增加α-LA熒光強(qiáng)度。當(dāng)壓力超過(guò)110 MPa，LA-140熒光強(qiáng)度降低，與Maresca等[18]的研究結(jié)果類似。經(jīng)乳糖美拉德反應(yīng)后，LA-Lac體系的熒光強(qiáng)度顯著降低，可能是因?yàn)棣?LA與乳糖的結(jié)合對(duì)部分色氨酸起到了屏蔽作用。且隨處理壓力的增大，熒光強(qiáng)度先增后減，LA-110-Lac的熒光強(qiáng)度達(dá)最低，可能是LA-110-Lac的美拉德反應(yīng)程度最大，結(jié)合的乳糖最多，對(duì)色氨酸產(chǎn)生了更強(qiáng)的屏蔽效應(yīng)。

圖3 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA內(nèi)源性 熒光的影響

Figure 3 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the intrinsic fluorescence intensity ofα-LA

2.4 表面疏水性測(cè)定

圖4為α-LA的表面疏水性指數(shù)，經(jīng)DHPM改性后，LA-80、LA-110和LA-140的H0較N-LA顯著增大(P<0.05)。這和Ruan等[17]的研究結(jié)果一致，可能是壓力作用使α-LA構(gòu)象發(fā)生變化，內(nèi)部疏水性基團(tuán)部分暴露，H0增大。但經(jīng)140 MPa處理后，H0相較110 MPa處理有所下降，可能是蛋白質(zhì)分子之間存在疏水作用，當(dāng)暴露的疏水基團(tuán)較多時(shí)，會(huì)通過(guò)疏水作用重新聚合[19]。處理后的α-LA與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，LA-Lac的H0較LA的顯著增加(P<0.05)，且隨著壓力的逐漸增加，H0先顯著增加后降低(P<0.05)。這可能是α-LA與乳糖發(fā)生接枝反應(yīng)，α-LA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)[20]，掩蓋了周圍的親水性基團(tuán)[21]，增加了H0。當(dāng)壓力達(dá)到110 MPa，LA-110-Lac的H0達(dá)到最大值。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA表面 疏水性的影響

Figure 4 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the surface hydrophobicity ofα-LA

2.5 圓二色光譜分析

采用圓二色光譜分析α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)中各組分的含量。由圖5可知，DHPM預(yù)處理對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)中各組分的含量沒(méi)有顯著影響，與Subirade等[22]的結(jié)論相似；這也可能是α-LA 結(jié)合鈣離子，使其二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[23]。美拉德反應(yīng)后的結(jié)果見(jiàn)圖6和表1，α-LA的α-螺旋含量升高、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量降低，但樣品LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分之間沒(méi)有明顯差別，可能是因?yàn)椴煌膲毫μ幚矸绞綄?duì)α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不大。此外Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分變化與還原糖的分子量、蛋白質(zhì)和還原糖的質(zhì)量比、美拉德反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。說(shuō)明LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯可能是樣品發(fā)生美拉德反應(yīng)的條件一樣。

圖5 DHPM處理對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Figure 5 Effect of DHPM treatment on the secondary structure of α-LA

圖6 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA二級(jí) 結(jié)構(gòu)的影響

Figure 6 Effect of DHPM pretreatment combined with Maill-ard reaction on the secondary structure ofα-LA

表1 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響?Table 1 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the secondary structure content of α-LA %

? 同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 乳化性測(cè)定

食品中蛋白質(zhì)的乳化性一般通過(guò)乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)來(lái)評(píng)價(jià)。圖7為DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA乳化性的影響。經(jīng)DHPM預(yù)處理后，α-LA的EAI和ESI呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)處理壓力達(dá)到110 MPa，LA-110的乳化性最大。這可能是DHPM的瞬時(shí)高壓作用，使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，極性側(cè)鏈的水合作用增強(qiáng)，親水性提高；與此同時(shí)一些原先被包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，親油性增強(qiáng)，兩者達(dá)到較好的平衡，乳化性能增強(qiáng)[25]。但當(dāng)壓力高于110 MPa時(shí)，α-LA形成分子聚集體，表面疏水性減弱，水油平衡能力減弱，乳化能力下降。經(jīng)乳糖美拉德后，α-LA的乳化性顯著增大(P<0.05)，可能是α-LA與乳糖產(chǎn)生高分子量的糖結(jié)合物，它能與疏水性蛋白質(zhì)共軛結(jié)合，并牢固地吸附在水-油界面，同時(shí)親水性的糖類物質(zhì)可以高度溶解于水相介質(zhì)，從而提高蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)[26]。當(dāng)DHPM處理壓力達(dá)到110 MPa時(shí)，LA-110-Lac的EAI和ESI最大。這可能是110 MPa時(shí)，美拉德反應(yīng)程度最大，蛋白質(zhì)接枝上更多的糖類，生成更多的美拉德產(chǎn)物。當(dāng)壓力超過(guò)110 MPa，美拉德反應(yīng)程度降低，產(chǎn)生較少的蛋白質(zhì)-糖結(jié)合物，EAI和ESI值降低。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA乳化性的影響

Figure 7 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the emulsibility properties ofα-LA

2.7 ABTS+·清除能力

ABTS+·清除能力可以反映美拉德產(chǎn)物的抗氧化活性。不同DHPM處理壓力結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA的ABTS+·清除能力影響見(jiàn)圖8。經(jīng)DHPM預(yù)處理后，α-LA的ABTS+·清除能力沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明DHPM對(duì)α-LA的ABTS+·清除能力沒(méi)有顯著影響。而經(jīng)乳糖美拉德后α-LA的ABTS+·清除能力顯著提高(P<0.05)，可能是α-LA與乳糖產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物和ABTS+·反應(yīng)，使得α-LA體系的正離子自由基含量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 DHPM預(yù)處理結(jié)合美拉德反應(yīng)對(duì)α-LA 抗氧化活性的影響

Figure 8 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the antioxidative activity ofα-LA

的抗氧化能力增加[27]。隨著DHPM壓力的增加，ABTS+·清除能力先增加后降低，處理壓力為110 MPa時(shí)，LA-110-Lac的自由基清除率達(dá)到最大，這是由于DHPM促進(jìn)了α-LA 與乳糖的美拉德反應(yīng)，生成更多的美拉德產(chǎn)物。當(dāng)處理壓力為140 MPa，美拉德反應(yīng)程度降低，生成的美拉德產(chǎn)物含量減少，且文獻(xiàn)報(bào)道色氨酸具有自由基清除能力，而美拉德反應(yīng)的加熱條件會(huì)降低色氨酸的自由基清除能力[28]，因此LA-140-Lac的自由基清除率降低。

3 結(jié)論

DHPM預(yù)處理對(duì)α-LA的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，而對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著影響。經(jīng)DHPM預(yù)處理后α-LA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度和表面疏水性增大，且呈先升后降的趨勢(shì)，在處理壓力為110 MPa的條件下達(dá)到最大。說(shuō)明DHPM能改變?chǔ)?LA的三級(jí)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，使其乳化性增強(qiáng)。相對(duì)N-LA，DHPM預(yù)處理結(jié)合乳糖美拉德改性后的α-LA，其乳化性和抗氧化活性增強(qiáng)，且隨著處理壓力的增大，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在處理壓力為110 MPa時(shí)，乳化性和抗氧化活性最大。DHPM的作用使α-LA結(jié)構(gòu)松馳，更易與乳糖結(jié)合，促進(jìn)了美拉德反應(yīng)，生成更多的美拉德產(chǎn)物，能更加牢固地吸附在水-油界面，增強(qiáng)乳化性；能和ABTS+·反應(yīng)，減少正離子自由基，增強(qiáng)抗氧化活性。DHPM預(yù)處理結(jié)合乳糖美拉德反應(yīng)可以改變?chǔ)?LA結(jié)構(gòu)并提高其乳化性能和抗氧化活性，可以為α-LA改性提供一種新的方法。