張莉莉 孫蘇安

我國一直以來為食管癌高發(fā)地區(qū)，近年來隨著人們生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，食管癌的發(fā)病率明顯增加，主要包括腺癌、鱗癌兩種病理類型，以前者更為多見，預(yù)后差。手術(shù)仍是可切除食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)化治療方式，化、放療等為常見輔助治療手段，但高復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是影響患者預(yù)后的主要原因[1]。目前評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后的臨床常規(guī)病理學(xué)指標(biāo)有組織學(xué)類型、腫瘤分期、腫瘤體積、轉(zhuǎn)移情況等，其局限性越來越明顯，尋找新的能夠預(yù)測食管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)臨床治療管理具有重要意義[2]。作為腫瘤重要特征，免疫逃逸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。在眾多免疫因子中，程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1，programmed death-1)與其配體PD-L1通路系腫瘤免疫逃逸中極為關(guān)鍵的一環(huán)[3]。已有文獻(xiàn)證實(shí)PD-1/PD-L信號(hào)通路在多種腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用，如肺癌[4]、卵巢癌[5]、甲狀腺癌[6]、上皮源性惡性腫瘤[7]等。本研究通過免疫組化法明確食管癌組織中PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白表達(dá)情況，并分析其與病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為食管癌的預(yù)后評(píng)估以及治療靶點(diǎn)探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我院2012年4月至2014年10月病理科存檔的54例食管癌患者手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本，其中42例患者術(shù)中取得距離癌組織>5 cm的癌旁組織，病理切片證實(shí)沒有癌變。男39例，女15例；年齡36～77歲，平均年齡(54.07±8.56)歲；病變部位：頸或胸上段4例，胃食管交界4例，胸中段28例，胸下段18例；病理類型：腺癌3例，鱗癌51例；按照美國腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC，American Association of Cancer)食管癌TNM分期(2010年)[8]確定分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期31例，Ⅲ期9例；有6例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)相關(guān)要求。隨訪截止日期為2018年10月。

1.2 儀器與試劑 DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，LH50A型倒置相差顯微鏡，恒溫冰箱，免疫組化孵育盒及免疫組化抗原修復(fù)盒；兔抗人PD-1抗體、兔抗人PD-L1抗體，DAB試劑盒、SP-9001二抗試劑盒。

1.3 免疫組化檢測PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白 取54例癌組織與42例癌旁組織石蠟標(biāo)本，5 μm厚連續(xù)切片，60℃烤箱烤片>2 h，二甲苯中3次(10 min/次)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5 min。切片放置于塑料染色架，然后浸在pH值6.0的檸檬酸組織抗原緩沖液中，微波適當(dāng)加熱后取出自然冷卻至室溫。從緩沖液切片以蒸餾水沖洗2次，PBS沖洗3次，每次3 min(下同)。滴加過氧化物酶阻斷劑后于室溫下孵育，10 min后，PBS 洗3次，去除PBS后滴加一抗，然后置于4℃冰箱過夜；次日取出后室溫下復(fù)溫，PBS沖洗3次后去除PBS，每張切片滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次后去除PBS。接下來繼續(xù)顯色操作，滴加DAB顯色試劑，于顯微鏡下控制顯色時(shí)間，觀察3～5 min后(出現(xiàn)棕色本底)自來水沖洗終止顯色，給予蘇木精復(fù)原1 min后自來水沖洗反藍(lán)。最后進(jìn)行脫水透明與中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定 陽性結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[9]，以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PD-1/PD-L1陽性表達(dá)水平根據(jù)染色強(qiáng)度(3分為棕褐色、2分為棕黃色、1分為淡黃色、0分為無著色)與陽性細(xì)胞數(shù)百分比(隨機(jī)選取的5個(gè)高倍視野下，1分即陽性細(xì)胞率<10%，11%～50%為2分，>50%為3分)共同確定，即二者的乘積>3分為陽性表達(dá)，且認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上、癌細(xì)胞或癌間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞上任一項(xiàng)陽性則結(jié)果為陽性表達(dá)。癌組織、癌旁組織標(biāo)本免疫組化切片由2名具備>5年工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立觀察。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織中PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與癌旁組織比較，癌組織中PD-1、PD-L1蛋白陽性表達(dá)率明顯升高(P<0.05)；且癌組織中PD-L1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于PD-1(P<0.05)。PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞與部分間質(zhì)細(xì)胞，PD-1則均表達(dá)于腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞。見表1，圖1。

表1 癌組織、癌旁組織中PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 例(%)

注：癌組織PD-1、PD-L1蛋白陽性表達(dá)率比較(χ2=4.558，P=0.033)

2.2 PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白表達(dá)與病理特征的關(guān)系 PD-1蛋白、PD-L1蛋白表達(dá)與食管癌患者年齡、性別、病變部位、病理類型無關(guān)(P>0.05)，與TNM分期明顯相關(guān)(其P<0.05)，且PD-L1蛋白表達(dá)還與遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)。見表2。

圖1 癌組織中PD-1、PD-L1(蛋白免疫組化染色×200)；A、B分別為PD-1蛋白陽性、陰性表達(dá)；CD分別為PD-L1蛋白陽性、陰性表達(dá)

表2 PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白表達(dá)與病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 預(yù)后分析 隨訪36～48個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，PD-1陽性、陰性表達(dá)者中位無病生存期(DFS，disease-free survival)分別為13個(gè)月(95%CI：9.5～16.0)、15個(gè)月(95%CI：9.8～18.1)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而PD-L1陽性、陰性表達(dá)者中位DFS分別為10個(gè)月(95%CI：7.6～13.7)、19個(gè)月(95%CI：16.9～21.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cox回歸模型分析表明，僅TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及PD-L1蛋白高表達(dá)是食管癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。見表3，圖2～3。

表3 影響影響食管癌DFS的單/多因素分析

3 討論

近年來，臨床腫瘤治療對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用上升到了新的高度，且免疫共刺激分子也成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。其中PD-1/PD-L信號(hào)通路可通過抑制T細(xì)胞的活化致使腫瘤免疫耐受，故有學(xué)者提出阻斷這一信號(hào)通路可能會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化并殺傷腫瘤細(xì)胞[10]。PD-1/PD-L相關(guān)蛋白中，作為免疫球蛋白CD28超家族的成員，PD-1是一種抑制性的協(xié)同刺激分子，常常表達(dá)于激活后的B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷性T細(xì)胞、激活的單核細(xì)胞及部分樹突狀細(xì)胞等。PD-1具有在T細(xì)胞外周效應(yīng)器活化的階段抑制T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)，并引起其配體PD-L1及PD-L2的細(xì)胞的免疫耐受。有研究顯示，PD-1可以通過下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR、AKT、S6、ERK2等的磷酸化和上調(diào)10號(hào)染色體缺失的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生、維持的目的，進(jìn)而可明顯抑制效應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮作用[11]。PD-L1是實(shí)體瘤中表達(dá)的主要PD-1配體，又屬于I型穿膜蛋白，常表達(dá)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、部分樹突狀細(xì)胞以及骨髓源性肥大細(xì)胞等。

圖2 PD-1蛋白表達(dá)與食管癌DFS的關(guān)系

圖3 PD-L1蛋白表達(dá)與食管癌DFS的關(guān)系

就分子機(jī)制而言，PD-L1只有表達(dá)在細(xì)胞膜上時(shí)才有生物學(xué)活性，能通過改變炎性介質(zhì)干擾素-γ表達(dá)及激活致癌基因而達(dá)到其生物學(xué)效應(yīng)[12]。有研究顯示，癌細(xì)胞中PD-L1分子表達(dá)的上調(diào)可以促使其轉(zhuǎn)移和浸潤，且使腫瘤細(xì)胞能夠躲過CD8 T細(xì)胞的攻擊，從而逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)[13]。張風(fēng)賓等[14]報(bào)道指出，PD-L1與B細(xì)胞上的PD-1結(jié)合后可以促使PD-1胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換機(jī)制結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化及信號(hào)分子Igα/β、Syk發(fā)生去磷酸化，繼而免疫抑制信號(hào)得以傳遞，最終使腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。

本研究分析食管癌組織中PD-1/PD-1相關(guān)蛋白表達(dá)情況，與病理參數(shù)的關(guān)系以及對(duì)預(yù)后的影響，通過免疫組化法檢測PD-1蛋白、PD-L1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，癌組織中PD-1及PD-L1蛋白陽性表達(dá)率皆明顯高(46.30% vs 9.52%，66.67% vs 16.67%)，且癌組織中PD-L1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于PD-1，這與韓向前等[15]結(jié)果類似，但該研究僅分析了食管癌組織PD-L1表達(dá)比正常食管組織高，并與浸潤深度(T分期)緊密相關(guān)。吳圣等[16]報(bào)道顯示PD-L1、PD-1在胃癌細(xì)胞、癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞表達(dá)較癌旁組織顯著升高，且兩種蛋白陽性率有差異(陽性率分別為38.41%、60.93%)，與本研究較為符合，但該研究中組織標(biāo)本為胃癌。而Chen等[17]162例食管癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)水平顯著高于周圍正常上皮組織。另外，有報(bào)道對(duì)PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的部位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)食管癌組織的胞膜、胞核、胞漿皆有PD-L1蛋白表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度顯著相關(guān)，而PD-1蛋白多局限于腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞表達(dá)[18]，與本文免疫組化結(jié)果一致，結(jié)合兩種蛋白的陽性表達(dá)情況，推測PD-L1與食管腫瘤的浸潤深度或預(yù)后密切相關(guān)，而PD-1的相關(guān)性可能不明顯。

本研究進(jìn)一步進(jìn)行病理特征與術(shù)后隨訪分析，發(fā)現(xiàn)PD-1蛋白及PD-L1蛋白表達(dá)與食管癌TNM分期明顯相關(guān)，且PD-L1蛋白表達(dá)還與遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。同時(shí)，生存曲線分析顯示，PD-1陽性、陰性表達(dá)者中位DFS無明顯差異，而PD-L1陽性表達(dá)者中位DFS明顯較陰性表達(dá)者縮短，且Cox回顧分析證實(shí)僅TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及PD-L1蛋白高表達(dá)是食管癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素，PD-1對(duì)預(yù)后的影響不突出，證實(shí)了前文推測。事實(shí)上，已有學(xué)者分析指出，PD-Ll與CD8 T細(xì)胞浸潤程度呈明顯正相關(guān)，而CD8 T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞起著直接殺傷作用，因此，PD-Ll的作用并不直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但可通過減少T細(xì)胞的增殖與存活促使腫瘤進(jìn)展、惡化，而PD-1的這一生物學(xué)效應(yīng)不明顯[19]。Ohigashi等[20]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測食管癌組織中PD-L1 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平高者預(yù)后差，并證實(shí)PD-L1 mRNA表達(dá)水平是食管癌的獨(dú)立預(yù)后因素。文松等[21]報(bào)道證實(shí)PD-Ll細(xì)胞通常提示免疫細(xì)胞浸潤，食管鱗癌組織中PD-Ll蛋白陽性表達(dá)往往預(yù)示著較差的預(yù)后。

綜上所述，食管癌中PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白陽性表達(dá)與病理特征以及預(yù)后密切相關(guān)，建議條件允許的情況下對(duì)食管癌患者進(jìn)行PD-L1、PD-1檢測，尤其是對(duì)于PD-L1蛋白高表達(dá)者可考慮應(yīng)用PD-L1抑制劑，但其是否能改善預(yù)后仍有待進(jìn)一步證實(shí)，且PD-1/PD-L1相關(guān)蛋白檢測方法、試劑及預(yù)后評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)可能影響結(jié)果，相關(guān)結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本量、多中心的研究論證。