吳 迪，王 林，栗云鵬，杜 鵑，張 瑋，張啟龍，高曉龍，程汝佳， 王 培，李 蕊，吳惠明，宋彥軍，韋海濤，周德剛

(北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629)

豬流行性腹瀉(Pofrcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起豬的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水為主要臨床特征的高度接觸性消化道傳染病[1]。豬流行性腹瀉多發(fā)于12月份至翌年4月份，在夏季也可發(fā)生[2]。各種年齡的豬都易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%[3]，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，病死率平均為50%[4]。PEDV為線性單股正鏈RNA，基因組全長27～33 kb，病毒的結(jié)構(gòu)蛋白由M、S、sM和N基因編碼，非結(jié)構(gòu)蛋白由ORF3編碼。PEDV毒株M基因十分保守，可以針對該基因設(shè)計引物進(jìn)行研究[5]。

2013-2015年倪建強等[6]對全國17個省的44個豬場開展了生豬腹瀉回溯性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)連續(xù)3年內(nèi)共24個養(yǎng)殖場發(fā)生腹瀉，采集發(fā)病豬進(jìn)行檢測均為PEDV陽性。2015-2016年王恩宇[7]對全國20個省的78個規(guī)?；B(yǎng)豬場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，共檢出243份PEDV陽性樣品。數(shù)據(jù)表明豬流行性腹瀉病毒仍是豬病毒性腹瀉的主要病原，是危害養(yǎng)豬業(yè)及經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法是由日本學(xué)者Notomi在2000年公開發(fā)明的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)[8]，該方法能在等溫(60～65 ℃)條件下，短時間內(nèi)進(jìn)行大量的核酸擴增，是一種“簡便、快速、精確、廉價”的基因擴增方法[9]。與常規(guī)PCR相比，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡單、快速、特異性強等特點[10]。LAMP的特征是針對靶基因上的六個區(qū)域設(shè)計四條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴增反應(yīng)[11]，通過添加鈣黃綠素可以肉眼觀察到陽性樣品出現(xiàn)黃綠色熒光。本研究建立的基于鈣黃綠素可視化LAMP檢測PEDV的方法，經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗，對特異性、靈敏性、應(yīng)用儀器設(shè)備與臨床樣品檢測進(jìn)行摸索試驗，建立了一種豬流行性腹瀉病毒 LAMP目視法檢測技術(shù)，以期應(yīng)用于PEDV現(xiàn)場快速診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 核糖核酸擴增試劑盒(生產(chǎn)批號:87001)、熒光目視檢測試劑盒(生產(chǎn)批號：94001)購自榮研生物科技有限公司。PEDV CV777株、PEDV AJ1102株、PEDV ZJ08株購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)由北京中科基因技術(shù)有限公司饋贈；豬瘟(CSFV)活疫苗C株購自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)R98株、豬偽狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株購自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司。PEDV實時熒光RT-PCR檢測試劑盒(生產(chǎn)批號：PED20190911P)購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備 Loopamp?實時濁度測定儀器購置于榮研生物科技有限公司。熒光定量PCR儀ABI Quant Studio7購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，TGuide S32全自動核酸提取純化儀購自天根生化科技有限公司，移液器購自德國Eppendorf公司。水浴鍋購自德國WIGGENS。金屬浴由北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的PEDV基因序列，包括經(jīng)典毒株CV777(GenBank: AF353511.1)、PEDV變異毒株AJ1102(GenBank: JX188454.1)、PEDV變異毒株AH2012(GenBank：KC210145.1)、PEDV變異毒株JXNC1302(GenBank：KJ526109.1)、PEDV變異毒株FJ-CL(GenBank：KJ646593.1)、PEDV變異毒株FJ-ZP(GenBank：KJ646609.1)、PEDV變異毒株GD-1(GenBank：JX647847.1)，通過多序列比對鑒定保守區(qū)域，運用在線生物軟件(http:∥primerexplorer.jp/)，通過調(diào)整Tm值、GC含量、dG臨界值、擴增長度和片段區(qū)域等參數(shù)值，設(shè)計3組適用于RT-LAMP的特異性外引物和內(nèi)引物，分別編號為引物組1、引物組2、引物組3，引物序列見表1-表3。通過實驗篩選出最佳的外引物和內(nèi)引物后，在此引物組的基礎(chǔ)上設(shè)計最佳的環(huán)引物，最終得到最佳引物組合引物組1。最佳引物組1在PEDV M基因組中位置見圖1，擴增序列201 bp，F(xiàn)IP引物是由(F2+F1c)引物組合，BIP引物是由(B2+B1c)引物組合。引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。

表1 引物組1序列Tab 1 Sequences of primers

表2 引物組2序列Tab 2 Sequences of primers

表3 引物組3序列Tab 3 Sequences of primers

c表示反向互補序列c represents reverse complementary sequence圖1 引物組1在PEDV M基因組中位置Fig 1 Position of primer group 1 in PEDV M genome

1.4 PEDV質(zhì)粒合成與核酸提取 通過比對PEDV經(jīng)典毒株與變異毒株的M基因保守序列，設(shè)計合成一段681 bp的PEDV質(zhì)粒，質(zhì)粒由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。對TGEV、PoRV、CSFV活疫苗C株、PRRSV R98株、PRV Bartha-K61株進(jìn)行核酸提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 本研究建立的RT-LAMP反應(yīng)體系25 μL，包含RT-LAMP預(yù)混液18 μL(2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL、5 μmol/L的外引物PEDV-F3 1 μL、5 μmol/L的外引物PEDV-B3 1 μL、40 μmol/L的內(nèi)引物PEDV-FIP 1 μL、40 μmol/L的內(nèi)引物PEDV-BIP 1 μL、20 μmol/L的環(huán)引物PEDV-LB 1 μL、無RNA酶的蒸餾水0.5 μL)；酶溶液 1 μL；熒光目視檢測試劑 1 μL；RNA樣品5 μL；擴增反應(yīng)工作程序為：65 ℃ 120 min。

以PEDV質(zhì)粒(10 ng/μL)為模板，利用建立的RT-LAMP反應(yīng)體系在Loopamp儀器上進(jìn)行擴增，設(shè)置60 ℃、63 ℃、65 ℃、68 ℃四個溫度進(jìn)行篩選。

1.6 特異性試驗 以提取的PEDV CV777株、PEDV AJ1102株、PEDV ZJ08株、CSFV、PoRV、TGEV、PRRSV R98株、PRV Bartha-K61株核酸為模板進(jìn)行LAMP檢測，評價建立的可視化RT-LAMP檢測方法的特異性。

1.7 靈敏度試驗 將合成的PEDV質(zhì)粒經(jīng)微量核酸蛋白檢測儀測定，濃度為10 ng/μL，按公式“拷貝數(shù)=(6.02×1023copies/mol×10ng/μL×10-9)/ (681bp×660g/mol) ”計算PEDV質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.34×1010copies/μL，將質(zhì)粒濃度稀釋到2×104copies/μL，按1∶10倍比稀釋，進(jìn)行RT-LAMP可視化檢測方法的靈敏度研究。同時，與市售的豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行比對，比較兩種檢測方法的靈敏性差異。

1.8 不同恒溫設(shè)備對LAMP檢測結(jié)果的影響 將濃度為2×104copies/μL的PEDV質(zhì)粒按1∶10倍比稀釋，稀釋到2×10-2copies/μL。分別在水浴鍋、金屬浴、PCR儀器3種不同恒溫設(shè)備進(jìn)行RT-LAMP可視化檢測反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件均為65 ℃ 45 min，比較不同恒溫設(shè)備對試驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.9 臨床樣品檢測 用已建立的可視化RT-LAMP檢測方法與實時熒光定量RT-PCR方法同時檢測已知背景的30份臨床樣品(其中22份為陰性樣品，8份為陽性樣品)，比對兩種檢測方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物組合的篩選 對設(shè)計出的3組引物，分別為引物組1、引物組2、引物組3，利用PEDV質(zhì)粒為模板，進(jìn)行LAMP濁度儀檢測，濁度儀擴增曲線如圖2所示，由圖可知，產(chǎn)生擴增速率曲線的時間：引物組1>引物組2>引物組3，所以引物組1 LAMP擴增效果最佳。

2.2 溫度范圍的篩選 以PEDV質(zhì)粒(10 ng/μL)為模板，利用建立的RT-LAMP反應(yīng)體系在Loopamp儀上進(jìn)行擴增，設(shè)置60 ℃、63 ℃、65 ℃、68 ℃五個溫度進(jìn)行最佳溫度的篩選，結(jié)果如圖3所示:A為在60 ℃條件下，PEDV質(zhì)粒在31 min出現(xiàn)擴增曲線；B為在63 ℃條件下，PEDV質(zhì)粒在25 min出現(xiàn)擴增曲線；C為在65 ℃條件下，PEDV質(zhì)粒在22 min出現(xiàn)擴增曲線；D為在68 ℃條件下，PEDV質(zhì)粒在42 min出現(xiàn)擴增曲線。由此可見，在65 ℃條件下，PEDV質(zhì)粒出擴增曲線時間最快，效果最好。

2.3 靈敏度試驗 通過倍比稀釋PEDV質(zhì)粒(2×104copies/μL～2×10-2copies/μL)，對本研究建立的RT-LAMP可視化快速檢測方法與熒光RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行靈敏度比對。圖4為可視化RT-LAMP檢測方法對引物組1進(jìn)行RT-LAMP的檢測結(jié)果，可以看出，可視化LAMP檢測方法可檢出到2 copies/μL。圖5為Real-time PCR檢測結(jié)果，可以看出，豬流行性腹瀉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢出到20 copies/μL。

1：引物組1+PEDV質(zhì)粒模板組合；2：引物組2+PEDV質(zhì)粒模板組合；3：引物組3+PEDV質(zhì)粒模板組合1: primer group 1 + PEDV plasmid template combination;2: primer group 2 + PEDV plasmid template combination;3: primer group 3 + PEDV plasmid template combination圖2 濁度儀擴增速率曲線Fig 2 Amplification rate curve of turbidimeter

圖3 不同溫度條件下產(chǎn)生的擴增曲線Fig 3 Amplification curve under different temperature conditions

1-7：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2×104 copies/μL～2×10-2 copies/μL)；8：陰性對照1-7: plasmids with different dilutions (2×104copies/μL ～ 2×10-2 copies/μL); 8: negative control圖4 PEDV靈敏度試驗檢測結(jié)果Fig 4 Detection results of PEDV sensitivity test

1：陽性對照；2-5：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2×104 copies/μL～20 copies/μL)；6-8：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2 copies/μL～2×10-2 copies/μL)；9：陰性對照1: positive control; 2-5: plasmids with different dilutions (2×104 copies/μL ～ 20 copies/μL);6-8: plasmids with different dilutions (2 copies/μL ～ 2×10-2 copies/μL); 9: negative control圖5 PEDV熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig 5 Detection results of PEDV by fluorescence quantitative PCR

2.4 特異性試驗 本研究的引物組合制備的試劑盒特異性檢測結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，本研究建立的LAMP可視化檢測方法特異性良好，可以檢出PEDV經(jīng)典株與變異株，與TGEV、PoRV、CSFV、PRV、PRRSV R98株無交叉反應(yīng)。

1：PEDV CV777株；2：PEDV AJ1102株；3：PEDV ZJ08株；4：TGEV；5：PoRV；6：CSFV；7：PRV；8：PRRSV R98株圖6 試劑盒特異性檢測結(jié)果Fig 6 Test results of kit specificity

2.5 不同設(shè)備對LAMP檢測結(jié)果的影響 分別在水浴鍋、金屬浴、PCR儀器3種不同設(shè)備進(jìn)行PEDV稀釋質(zhì)粒的LAMP可視化檢測反應(yīng)，3種設(shè)備設(shè)定溫度65 ℃，時間45 min，結(jié)果見圖7-圖9?？梢钥闯?，使用水浴鍋與金屬浴可以檢測到2 copies/μL，使用PCR儀器可以檢測到20 copies/μL。

1-7：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2×104 copies/μL～2×10-2 copies/μL)；8：陰性對照1-7: plasmids with different dilutions (2×104copies/μL ～ 2×10-2 copies/μL); 8: negative control圖7 水浴鍋LAMP檢測結(jié)果Fig 7 LAMP test results of water bath

1-7：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2×104 copies/μL～2×10-2 copies/μL)；8：陰性對照1-7: plasmids with different dilutions (2×104copies/μL ～ 2×10-2 copies/μL); 8: negative control圖8 金屬浴LAMP檢測結(jié)果Fig 8 LAMP test results of metal bath

1-7：不同稀釋濃度質(zhì)粒(2×104 copies/μL～2×10-2 copies/μL)；8：陰性對照1-7: plasmids with different dilutions (2×104copies/μL ～ 2×10-2 copies/μL); 8: negative control圖9 PCR LAMP檢測結(jié)果Fig 9 LAMP test results of PCR

2.6 LAMP可視化臨床檢測試驗 用已建立的可視化RT-LAMP檢測方法與實時熒光定量RT-PCR方法同時檢測已知背景的30份臨床樣品(其中22份為陰性樣品，8份為陽性樣品)，比對兩種檢測方法的符合率，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，建立的RT-LAMP方法與熒光定量RT-PCR方法檢測結(jié)果一致，符合率為100%。

表4 RT-LAMP與熒光定量RT-PCR方法檢測結(jié)果Tab 4 Detection results of RT-LAMP and quantitative RT-PCR

3 討論與結(jié)論

目前對于PEDV的檢測，常用的檢測技術(shù)包括病毒的分離鑒定、PEDV抗原檢測以及常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR與實時熒光RT-PCR等方法[12]。近年來雖然有一些研究者針對PEDV開發(fā)了基于LAMP的檢測方法，但上述方法中依然存在著檢測靈敏度相對較低、無法實現(xiàn)對不同流行毒株同時檢測的不足，而且檢測結(jié)果需要通過跑膠查看[13]，由于LAMP反應(yīng)可在15～60 min內(nèi)實現(xiàn)109～1010倍的擴增，大大增加了實驗室發(fā)生氣溶膠污染的風(fēng)險，嚴(yán)重制約著在實際檢測中的應(yīng)用。本研究建立的PEDV RT-LAMP可視化快速檢測方法在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上添加了鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，無需后續(xù)的電泳檢測，在觀察結(jié)果時無需開蓋，可直接通過顏色變化進(jìn)行肉眼判定，提高了檢測的靈敏度與安全性，避免了假陽性的出現(xiàn)[14]。

建立的PEDV RT-LAMP可視化檢測方法在水浴鍋、金屬浴、PCR儀器3種恒溫設(shè)備均可通過肉眼觀察顏色變化做出陽性判斷,說明本研究建立的方法對儀器設(shè)備使用要求不高，即具備恒溫條件即可，為今后在臨床現(xiàn)場快速檢測提供了便捷條件。在水浴鍋與金屬浴中可檢測到2 copies/μL，在熒光定量PCR儀器中可檢測到20 copies/μL,分析原因可能在PCR啟動過程中需要先預(yù)熱到105 ℃的熱蓋溫度，對PEDV LAMP反應(yīng)體系中的反轉(zhuǎn)錄酶活性產(chǎn)生一定影響，而PCR反應(yīng)管在水浴鍋與金屬浴中受熱均勻，所以產(chǎn)生較好試驗結(jié)果。通過對反應(yīng)條件的試驗摸索表明，建立的檢測方法能在65 ℃ 45 min內(nèi)特異性擴增PEDV，與TGEV、PoRV、CSFV、PRV、PRRSV R98株無交叉反應(yīng)。靈敏度比目前市售的熒光定量PCR檢測試劑盒高出一個梯度，RT-LAMP擴增時間為45 min，熒光定量RT-PCR擴增時間約為80 min，RT-LAMP反應(yīng)時間比熒光定量RT-PCR快35 min，節(jié)省了反應(yīng)時間。

本研究建立的PEDV RT-LAMP可視化快速檢測方法，在65 ℃ 45 min內(nèi)可以檢出2 copies/uL濃度的PEDV，靈敏度高于市售PEDV熒光定量PCR檢測試劑盒，與TGEV、PoRV、CSFV、PRV、PRRSV R98株均無交叉反應(yīng)，臨床樣品比對試驗符合率與熒光定量PCR方法一致,可在水浴鍋、金屬浴、PCR儀器進(jìn)行操作，適用于臨床PEDV的現(xiàn)場快速檢測。