李 建，魏紫嫣，王佳雅，張晶晶，黃川鄰，王利丹，孫志文*，葉能勝*

(1.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037；2.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102629；3.首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京 100048；4.中國合格評定國家認(rèn)可委員會，北京 100062)

泰拉霉素(tulathromycin)又名土拉霉素，是一種新近上市且為動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，主要用于治療由胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌和支原體等引起的家畜呼吸系統(tǒng)疾病[1]，我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號公告中首次允許泰拉霉素在動物生產(chǎn)中使用，主要用于牛和豬呼吸系統(tǒng)疾病的防治[2]。目前，我國將泰拉霉素作為專用抗生素在牛、豬養(yǎng)殖過程中，用以防治由敏感菌引起的牛、豬呼吸系統(tǒng)感染性疾病以及由牛莫拉氏菌引起的牛傳染性角膜結(jié)膜炎[3]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對泰拉霉素在豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)及生物利用度等指標(biāo)[4-5]進(jìn)行了系統(tǒng)研究以指導(dǎo)養(yǎng)豬行業(yè)的合理用藥，同時國外相關(guān)研究針對動物用藥后藥物在血漿中分布情況[6-9]及藥代動力學(xué)[10]也進(jìn)行了分析。研究表明，隨著用藥時間的延長以及用藥量的不斷增大，泰拉霉素在動物體性組織中會出現(xiàn)不同程度的藥物殘留[11-16]，歐洲藥品評價局(EMEA)相關(guān)資料(EMEA/MRL/894/04)表明：泰拉霉素在豬體內(nèi)的殘留量由皮膚+脂、肌肉、腎臟、注射部位到腎臟逐漸增高，并給出了豬組織中的最高殘留限量(MRL)：皮膚脂肪100 μg/kg，肝臟3000 μg/kg，腎臟3000 μg/kg。我國目前還并沒有泰拉霉素殘留檢測相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測泰拉霉素的研究主要集中在雞肉[17]、豬肉[18]以及牛肉[19]等動物組織[20]，對于豬組織中泰拉霉素的分析檢測研究的報道很少[21]。另有針對動物組織中泰拉霉素及其代謝物的樣品前處理技術(shù)的報道，主要有加壓液相萃取[22]和分子印跡固相微萃取技術(shù)[23-24]等。本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了豬組織中泰拉霉素及其代謝物的分析檢測方法，采用基質(zhì)外標(biāo)法定量，分別對豬肉、肝臟、腎臟中的泰拉霉素及其代謝物進(jìn)行了分析檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；勻漿儀(中國安信匯康)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates公司)；溶劑過濾器(美國PALL公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)。

1.1.2 試劑 泰拉霉素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品由艾美科健(中國)生物醫(yī)藥有限公司提供，含量分別為99.5%和98.5%；乙腈、甲醇、甲酸，購自美國Thermo Fisher Scientific公司，均為質(zhì)譜純；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL)，購自美國Waters公司；正己烷、氨水，分析純，購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱取試料2±0.02 g于50 mL離心管內(nèi)，渦旋混合，加入提取液(乙腈+0.1%甲酸水，7+3)10 mL，震蕩10 min，10000 r/min離心5 min，取上清于另一干凈50 mL離心管中，剩余殘渣重復(fù)提取，加入5 mL提取液，重復(fù)提取一次，合并上清液。在以上提取液中加入10 mL正己烷，振蕩10 min，5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液作為備用液。

MCX固相萃取柱依次用甲醇3 mL、2%甲酸水3 mL活化，取全部備用液過柱，依次用2%甲酸水3 mL、甲醇3 mL淋洗，然后用5%氨化甲醇2 mL洗脫，并收集洗脫液于10 mL離心管中，于40 ℃氮?dú)獯蹈?。?0%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)1.0 mL復(fù)溶，充分漩渦混勻，14000 r/min離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。高濃度樣品稀釋后上機(jī)檢測。

1.2.2 液相色譜參考條件 液相色譜條件：BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A：乙腈；B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of liquidchromatography

1.2.3 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150 ℃；霧化溫度：450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：700 L/h。定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密稱取適量泰拉霉素、泰拉霉素代謝物標(biāo)品，用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL貯備液，再吸取不同體積貯備液配制6個不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液(5，10，50，100，200，500 μg/kg)，以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 泰拉霉素及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Mass spectrometric determination paramete of tulathromycin and its metabolite

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 采用6個不同濃度5，10，50，100，200，500 μg/kg基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在5～500 μg/kg的濃度范圍內(nèi)泰拉霉素及其代謝物色譜峰面積與濃度呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均>0.99。泰拉霉素及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

表3 泰拉霉素及其代謝物豬組織基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 3 The matrix standard curve of tulathromycin and its metabolite for pork, pig liver and kindey

2.2 檢測方法靈敏度 方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢出限；按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白試樣中，分別制備得到5 μg/kg和10 μg/kg的添加樣品(豬肉：2 μg/kg)，經(jīng)前處理后檢測，檢出限(LOD)滿足信噪比 S/N=3，定量限(LOQ)滿足信噪比S/N =10，該方法檢出限為5 μg/kg(豬肉：2 μg/kg)，定量限為10 μg/kg。

2.3 實(shí)際樣品檢測應(yīng)用 在上述優(yōu)化最佳條件下，將本方法應(yīng)用于豬肉、肝臟和腎臟中泰拉霉素及其代謝物的分析檢測，并取得了較好的應(yīng)用效果。泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖、豬肉、肝臟和腎臟空白色譜圖以及豬肉、肝臟和腎臟添加特征色譜圖見圖1～圖7。

圖1 10 ng/mL泰拉霉素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖Fig 1 The chromatogram of tulathromycin and its metabolite for standard solution (10 ng/mL)

圖2 泰拉霉素及其代謝物豬肉空白特征離子色譜圖Fig 2 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pork

圖3 豬肉添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 3 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pork(10 μg/kg)

圖4 泰拉霉素及其代謝物豬肝臟空白特征離子色譜圖Fig 4 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig liver

圖5 豬肝臟添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 5 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig liver(10 μg/kg)

圖6 泰拉霉素及其代謝物豬腎臟空白特征離子色譜圖Fig 6 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig kidney

圖7 豬腎臟添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 7 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig kidney(10 μg/kg)

2.4 檢測方法準(zhǔn)確度和精密度 分別準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使組織中泰拉霉素及其代謝物濃度分別為10、3000、6000 μg/kg(豬肉、肝臟、腎臟)，按上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行測定，高濃度樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再測定。一日內(nèi)每種藥物的每個添加濃度取5個平行樣品分別進(jìn)行測定，計算回收率和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；每個添加濃度設(shè)5個平行，每天測定1批，重復(fù)測定3 d，計算回收率和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。豬組織樣品中泰拉霉素及其代謝物在10～6000 μg/kg添加水平內(nèi)的平均回收率在72.6%～105.8%之間，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～12.1%之間，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%～8.1%之間。具體結(jié)果詳見表4～表6。

表4 豬肉中添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 4 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pork

表5 豬肝臟中添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 5 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pig liver

表6 豬腎臟中添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 6 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pig kidney

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品提取條件優(yōu)化 泰拉霉素為弱堿性化合物，易溶于酸性溶液和極性溶液，因此，在樣品前處理過程中分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙腈+0.1%甲酸水(7+3)和0.1%甲酸水四種樣品提取溶液對豬組織中泰拉霉素的提取效率。實(shí)驗(yàn)中乙腈和0.1%甲酸乙腈加入豬組織中會立即產(chǎn)生蛋白質(zhì)凝集沉淀，不宜于組織的渦旋分散，從而影響泰拉霉素的提取效率；0.1%甲酸水雖然能夠使豬組織渦旋分散，但是無法使蛋白質(zhì)變質(zhì)沉淀，提取液渾濁不利于后續(xù)的凈化操作；乙腈+0.1%甲酸水(7+3)不僅能夠使豬組織渦旋分散，而且能夠使蛋白質(zhì)變質(zhì)沉淀，提取上清液雜質(zhì)較少，同時正己烷除脂能夠使上清液更加干凈，有利于后續(xù)提取液的凈化過程。因此，本實(shí)驗(yàn)的樣品提取液最終選擇乙腈+0.1%甲酸水(7+3)。

3.2 樣品凈化條件優(yōu)化 由于泰拉霉素含有3個氨基基團(tuán)，具有一定的離子性，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用陽離子固相萃取柱對提取液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)中分別選取了弱陽離子交換柱(WCX)、混合型陽離子交換柱(MCX)和強(qiáng)陽離子交換柱(SCX)對泰拉霉素的提取效果進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：SCX柱和WCX柱對泰拉霉素的回收率均低于MCX柱(圖8)，這可能是因?yàn)镾CX柱是強(qiáng)陽離子交換柱，對泰拉霉素的保留太強(qiáng)，導(dǎo)致泰拉霉素的回收率偏低；而WCX柱屬于弱陽離子交換柱，對泰拉霉素的保留不強(qiáng)而導(dǎo)致回收率偏低。MCX柱屬于混合陽離子交換柱，兼具離子交換和反相的特點(diǎn)，對堿性化合物具有較高的選擇性和靈敏度，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇MCX固相萃取柱用于樣品凈化。

圖8 三種不同陽離子交換柱對泰拉霉素及其代謝物的回收率(三種交換柱中第一個均為泰拉霉素，第二個均為泰拉霉素代謝物)Fig 8 The recoveries of tulathromycin and its metabolite for three different cation exchange columns

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用BEH C18反相色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)進(jìn)行了色譜條件優(yōu)化，可使目標(biāo)物在較短的時間內(nèi)得到很好的色譜圖。實(shí)驗(yàn)中以乙腈-0.1%甲酸水為流動相，對不同梯度條件下的色譜保留進(jìn)行了考察，最終確定了泰拉霉素及其代謝物的色譜分離條件。

3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化 泰拉霉素為堿性化合物，容易獲得一個氫離子而帶正電，本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源進(jìn)行正離子掃描，先通過一級全掃描質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰([M+H]+)，隨后進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析，通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)，最終確定了泰拉霉素及其代謝物的定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量。

本研究建立了豬組織中泰拉霉素及其代謝物殘留的分析檢測方法，樣品經(jīng)提取、凈化等處理，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測。結(jié)果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠滿足對豬肉、肝臟和腎臟中泰拉霉素及其代謝物的殘留分析檢測，同時也為相關(guān)檢測單位提供了技術(shù)支持。