曾濤濤,張詩琦,胡 青,付云書,蔡萍莉,榮麗杉

(南華大學 污染控制與資源化技術湖南省高校重點實驗室,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

硒(Se)對人類健康有著極為重要的作用，但在采礦、金屬冶煉、燒煤火電廠及局部農(nóng)業(yè)灌溉中，產(chǎn)生的硒濃度稍高就會污染環(huán)境[1]，局部地方硒濃度甚至達到10 mg/L以上[2]。硒在自然界中主要以+6、+4、0和-2價四種價態(tài)存在[3]，其中Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)容易遷移擴散，引起硒污染[4]。國家對含硒廢水處理日益重視，在2015年《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(征求意見稿)中，將總硒排放限值定為0.01 mg/L[5]。

傳統(tǒng)物理、化學方法處理含硒廢水包括：膜分離、混凝沉淀、吸附、電化學等[6]。這些方法存在成本高、能耗大，容易產(chǎn)生二次污染等問題。微生物可將高價硒還原成Se(0)，來降低硒污染風險，受到研究者重視。

研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、假單胞菌、腸桿菌、希瓦氏菌等[4,7]具有去除硒能力。李丹等[8]發(fā)現(xiàn)沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustrisstrain N)對2 mmol/L亞硒酸鹽還原率達到91.4%。廖青等[9]從廣西富硒區(qū)土壤中分離出8株硒能力較強的菌株，其在固體培養(yǎng)基中對硒的耐受濃度在10 000 μg/mL以上，分子生物學鑒定結果發(fā)現(xiàn)主要為芽孢桿菌與粘質(zhì)沙雷氏菌。J.Zhang等[10]從安徽富硒土壤中分離到兩株細菌，經(jīng)過鑒定為Lysinibacillusxylanilyticus與Lysinibacillusmacrolides，它們在36 h內(nèi)可完全去除1 mmol/L的亞硒酸鈉。H.Ayano等[11]從土壤中分離得到一株Pseudomonassp.(假單胞菌)，能同時去除1 mmol/L的Se(Ⅳ)和Cd(Ⅱ)。

目前，已有分離的除硒菌主要從土壤中獲得。為了研究水體中除硒菌特性，作者從江西某富硒泉水中取樣，分離純化亞硒酸鹽還原菌，并進行分子生物學鑒定；探討其耐硒能力與除硒效果；通過掃描電鏡、紅外光譜分析等技術分析細菌除硒機理。

1 材料與方法

1.1 富硒水樣采集

從江西省宜春市某富硒溫泉、古井及山泉中取水樣，收集在預先用體積比例為5%的硝酸清洗干凈的聚乙烯瓶中，水樣保存在4 ℃冰箱中直至分析。試驗中總硒含量采用3′3-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法測定[12]。

1.2 亞硒酸鹽還原菌分離

配制LB固體培養(yǎng)基，取100 μL水樣，采用涂布稀釋與平板劃線法，在25 ℃、好氧條件下，培養(yǎng)3 d分離出純菌落，觀察其形態(tài)特征。生理生化特征主要分析溶解氧、溫度、pH、接種率、初始亞硒酸鈉濃度等對菌落生長的影響。設置4因素4水平正交試驗(表1)，測定細菌的最適生長條件。

表1 正交試驗因素與水平設置

1.3 細菌耐硒能力測定

為了研究細菌的耐硒能力，將處于對數(shù)期的B-E細菌菌懸液(OD600=0.9)，按10%體積比比例加入到亞硒酸濃度分別為1～7 mmol/L的LB培養(yǎng)基中，在有氧(DO=6.56)、30 ℃、pH=7.5、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫震蕩器中反應18 h，測定OD600值，以此來衡量細菌生長情況。所有試驗均設置三組平行，計算平均值與相對誤差。

1.4 菌屬分子生物學鑒定

通過16S rDNA基因進行分離菌株的分子生物學鑒定。DNA提取使用基因組DNA分離試劑盒(TSP101-50)進行提取，采用超微量分光光度計測定DNA濃度，以27F和1492R通用引物進行16S rRNA基因PCR擴增[10]。

PCR反應體系包含：金牌MIX酶30 μg/L、引物12 μg/L、引物22 μg/L和模板1 μg/L。擴增步驟為：首先，DNA在98 ℃下進行初始變性120 s；然后，進行35個循環(huán)，包括在98 ℃下變性10 s，在55 ℃下退火10 s，在72 ℃下延伸20 s；獲得的序列在72 ℃下終延伸2 min；然后，使用ABI3730XL測序儀進行16S rDNA序列測定。用MEGA 7.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析[13]，并將所得16S rRNA基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得基因登錄號為：MF403055、MF576499、MF576500和MF576501。

1.5 亞硒酸鹽還原菌除硒效果

因為亞硒酸鹽還原菌可將Se(Ⅳ)還原為紅色單質(zhì)硒Se(0)，所以通過LB培養(yǎng)基顏色變化(出現(xiàn)紅色)，可定性確定菌株對亞硒酸鹽還原能力[14]。根據(jù)工業(yè)含硒廢水中常見硒含量[15]，分別配制初始亞硒酸鈉濃度為3.0、4.9、6.0、12.0、33.0 mg/L的人工含硒廢水，分析亞硒酸鹽還原菌除硒效果。

1.6 除硒機理分析

1.6.1 細菌表面形態(tài)觀察

通過SEM-EDS分析除硒前、后細菌表面形態(tài)特征及元素含量。樣品處理方法為：首先，用體積比例為2.5%的戊二醛固定4 h；此后，用磷酸緩沖液(PBS緩沖液)(pH7.2)洗滌3次；然后分別用體積比例為30%、50%、70%、85%、90%乙醇脫水1次，100%乙醇脫水2次，每次20 min；最后，用六甲基二硅氮烷覆蓋樣品，以提高樣品在顯微鏡下可見度，將處理好的樣品固定在玻璃培養(yǎng)皿中，在干燥器中冷凍干燥24 h；最后，利用掃描電鏡(Zeiss EVO18型)觀察除硒前后細菌形態(tài)，利用能譜儀分析元素組成及比例。

1.6.2 細菌官能團作用分析

用傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet Avatar 460)采集除硒前、后細菌官能團光譜特征(4 000～300 cm-1)，分析細菌官能團在硒去除中的作用。樣品預處理方法：將樣品冷凍干燥，與適量KBr晶體混合，完全研磨直至無小顆晶體的粉末，壓制在砂漿中，進行檢測。

2 結果與討論

2.1 分離細菌特性分析

將分離得到4株細菌命名為B、C、D、E菌，它們的菌落特征相似，表現(xiàn)為白色、圓形、長(2.73±0.2)μm、寬(0.76±0.1)μm、表面粗糙、不透明、邊緣起伏、質(zhì)地柔軟等。經(jīng)過革蘭氏染色，顯示4株細菌均為革蘭氏陽性菌。B-E菌的耐硒能力結果如圖1所示。

當亞硒酸鈉濃度為1～2 mmol/L時，B、C、D細菌OD600值變化不大，說明這三株菌生長較慢；當亞硒酸鈉濃度為5 mmol/L時，4株細菌OD600均最大，代表它們生長最佳；當亞硒酸鈉濃度為7 mmol/L(553 mg/L)，B、C、D細菌OD600值在2.0左右，而E細菌OD600接近3.0，表示這些細菌仍生長良好。成永麗等[13]從植物根瘤中分離出6株根瘤菌，它們對硒的耐受能力在3～6 mg/L之間。舒梅等[16]從富硒地區(qū)的農(nóng)家酸菜中分離篩選出2株乳酸菌，可耐受終濃度320 mg/L的亞硒酸鈉。而本實驗分離的4株細菌對亞硒酸鈉耐受性達到553 mg/L，說明屬于超強耐硒菌。

正交試驗結果如表2所示。B、C、E細菌的適宜溫度35 ℃，適宜pH值為7.0或7.5，需要適宜的亞硒酸鈉濃度。而D細菌適宜溫度為45 ℃，不需要亞硒酸鈉的條件生長良好。對于各細菌，影響因素的主次順序為B菌：pH>溫度>接種率>SeO32-初始濃度；C菌：溫度> pH>接種率> SeO32-初始濃度；D菌：SeO32-初始濃度>溫度> pH>接種率；E菌：溫度> pH>接種率> SeO32-初始濃度。

2.2 分離細菌的菌屬鑒定

將B-E菌16S rDNA基因測序所得結果，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖2所示。序列比對發(fā)現(xiàn)4株細菌與芽孢桿菌屬相似度最高(>99%)。其中，B、C、E菌與芽孢桿菌屬(Bacillussp)分支更接近，而D菌與Bacilluscereus菌屬在一個分支，說明B、C、E菌相互間親緣關系較近。綜合考慮B-E菌的16S rDNA基因序列相似性分析結果與系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷分離純化的B-E菌為芽孢桿菌屬。

表2 B-E菌最適生長條件

芽孢桿菌在硒去除中有較多報道，R.R.Mishra等[17]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)可在40 h內(nèi)去除0.25 mmol/L的亞硒酸鈉。袁永強等[18]研究了Bacillussp.SeRB-2對亞硒酸鈉的還原動力學，發(fā)現(xiàn)Se(Ⅳ)的細菌還原符合一級反應動力學，還原反應主要集中在對數(shù)期和穩(wěn)定生長前期，對1 mmol/L的Se(Ⅳ)還原效率最高可達90%，可有效降低硒污染程度。因此，本研究也繼續(xù)探討分離的亞硒酸鹽還原菌除硒效果。

2.3 亞硒酸鹽還原菌除硒效果

作者此前曾發(fā)現(xiàn)，微生物可以將高價硒還原為硒單質(zhì)，使培養(yǎng)液變紅[14]，本試驗發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，說明B-E菌具有還原亞硒酸鹽的能力。4株細菌在18 h內(nèi)，對亞硒酸鈉濃度為3.3、4.9、6.0、12.0、33.0 mg/L的人工廢水均有很好的去除效果；對33.0 mg/L亞硒酸鈉去除效果最好(>99.7%)。舒梅等[16]分離篩選出2株乳酸菌，當培養(yǎng)液含亞硒酸鈉濃度為20 mg/L時，菌株對硒的轉(zhuǎn)化率可達74.5%。而本實驗分離的B-E菌去除硒能力更高。選擇B菌來考察其對高濃度硒去除效果，75 h內(nèi)對2.5 mmol/L(197.5 mg/L)亞硒酸鈉去除情況如圖3所示。

在0～20 h，總硒濃度從2.5 mmol/L下降到1.1 mmol/L，去除率為56%；對應的OD600值從接近0升高到1.6。在12～50 h，總硒濃度進一步下降到0.36 mmol/L，總硒累積去除率達到85.6%，OD600值升高到最大值2.7。此后到75 h，總硒濃度小幅度下降到0.22 mmol/L，總硒累積去除率達到91.2%，此階段OD600值略有下降，但依然保持在2.2以上。本研究分離的芽孢桿菌除硒能力高于此前報道的巨大芽孢桿菌[17]、Bacillussp.SeRB-2[18]等，說明分離的細菌具有處理高濃度含硒廢水的潛力。

2.4 除硒機理分析

2.4.1 細菌表面形態(tài)及元素變化

將處理高濃度含硒廢水的B菌，進行SEM-EDS分析，結果如圖4所示。放大20 000倍后的SEM結果顯示，細菌成桿狀，寬約0.8～1 μm，長約1.2～2 μm，與此前報道的芽孢桿菌形態(tài)類似[18]。除硒前細菌形態(tài)飽滿、表面光滑，除硒后細菌表面出現(xiàn)褶皺，少部分細菌塌陷，但大部分細菌依然形態(tài)完整。這表明分離的芽孢桿菌能夠耐受高濃度亞硒酸鹽。

EDS結果顯示，除硒前，細菌表面未含有硒元素。而除硒后，表面積上出現(xiàn)明顯的硒峰(1.38～1.40 keV)，表明細菌表面存在一定量的硒。統(tǒng)計元素含量分析，發(fā)現(xiàn)硒元素占細菌表面元素比例的9.87%(表3)，可確定細菌對硒的富集作用。

2.4.2 細菌官能團作用分析

與其它官能團峰位變化幅度相比，羥基、蛋白酰胺帶Ⅱ的酰胺基峰位變化最顯著，移動約80 cm-1；蛋白酰胺帶I基團峰位移動約17.5 cm-1。推測此變化主要是由于亞硒酸根離子與羥基、酰胺基之間的相互作用引起的[19]，即酰胺基及羥基團在亞硒酸鈉吸附去除中起到重要作用。因此，亞硒酸鹽還原菌對硒除了有還原效果之外，還有吸附作用，具體還原機理，將在后續(xù)研究中探討。

表3 EDS檢測的元素含量

3 結 論

1)分離獲得4株亞硒酸鹽還原菌，均具有很強的亞硒酸耐受能力，在7 mmol/L(553 mg/L)的亞硒酸濃度下生長良好，分子生物學鑒定發(fā)現(xiàn)4株細菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2)4株亞硒酸鹽還原菌具有良好的除硒能力，它們在18 h內(nèi)對33 mg/L亞硒酸鈉去除率均高于99.7%；B菌在75 h內(nèi)對高濃度亞硒酸鈉(197.5 mg/L)去除率在達到91.2%。

3)掃描電鏡能譜(SEM-EDS)分析表明，細胞在高濃度含硒廢水處理下形態(tài)完整，細胞表面存在硒元素。紅外光譜(FTIR)分析表明，酰胺基及羥基團在細菌吸附除硒中起重要作用。