邢晉放

復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院/上海市浦東醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（上海 201399）

陰莖海綿體是調(diào)控勃起功能的重要組織，在海綿體中，平滑肌組織約占40%-52%[1]，平滑肌的功能是完成陰莖的舒張及勃起，因此，平滑肌的含量對(duì)勃起功能產(chǎn)生直接影響，定量評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌的含量具有重要意義。目前，定量評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌含量必須采用有創(chuàng)的組織活檢技術(shù)，由于陰莖器官的特殊性，有創(chuàng)方法的臨床應(yīng)用十分受限。

實(shí)時(shí)剪切波彈性成像 (shear wave elastrography,SWE)是一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)的新型超聲定量檢查技術(shù)，該技術(shù)成像原理不同于常規(guī)灰階超聲 （brightness mode ultrasonography,B 型超聲），B 型超聲主要從形態(tài)學(xué)方面觀察病變，SWE 基本原理是利用探頭發(fā)射聲輻射力脈沖，進(jìn)入組織導(dǎo)致組織粒子振動(dòng)并產(chǎn)生橫向剪切波，成像系統(tǒng)可以精確檢測(cè)出感興趣區(qū)組織中橫向剪切波的速度（shear wave velocity,SWV）并進(jìn)行實(shí)時(shí)成像和推算出被測(cè)組織的彈性量化測(cè)值（shear wave elastic quantitative measurement,SWQ）[2-4]。組織的細(xì)胞種類及含量可以直接影響SWV，從理論上講，SWQ 可以反映出被測(cè)組織細(xì)胞種類及含量的改變； 同時(shí)，初步研究發(fā)現(xiàn)，SWE 技術(shù)在陰莖疾病診斷方面具有價(jià)值[5-8]。據(jù)此，本研究試圖利用SWE 技術(shù)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞含量不同的大鼠陰莖組織，探討SWQ 是否可以定量評(píng)價(jià)平滑肌含量的變化。

材料與方法

一、動(dòng)物及試劑

（一）動(dòng)物

20 只健康雄性SD 大鼠分成低年齡組（5-6 周齡，10 只）和高年齡組（52-60 周齡，10 只），20 只大鼠飼養(yǎng)環(huán)境完全相同。

（二）試劑

兔抗大鼠α-actin 抗體(ab82247,abcam)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體(ab6734,abcam)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）SWE 檢查

1、SWE 成像

采用5%水合氯醛（劑量0.6 ml/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后取仰臥位，固定四肢，充分暴露陰莖后開(kāi)始進(jìn)行SWE 成像，儀器采用AixplorerR新聲威超聲診斷儀 （SuperSonic Imagine,France），探頭為SL 15-4，取陰莖橫切面進(jìn)行掃查，B 型超聲清晰顯示陰莖組織后啟動(dòng)SWE，圖像優(yōu)化選擇“Pen”，SWE 成像框應(yīng)大于陰莖橫切面。分別選取陰莖近陰莖頭部、中部及近根部進(jìn)行SWE 成像并實(shí)時(shí)存圖。

2、SWQ 測(cè)量

選取質(zhì)量合格的SWE 圖像進(jìn)行SWQ 測(cè)量，質(zhì)量合格SWE 圖像的標(biāo)準(zhǔn)是： 感興趣區(qū)內(nèi)色彩充填完整、呈油畫(huà)樣充填，無(wú)馬賽克樣彩色斑點(diǎn)。測(cè)量感興趣區(qū)（圓形）的劃定標(biāo)準(zhǔn)為以包膜為外界最大范圍地包繞陰莖，分別對(duì)陰莖頭部、中部及根部進(jìn)行SWQ 測(cè)量，單位為kPa。

（二）陰莖平滑肌含量分析

1、取材

大鼠麻醉后，從陰莖根部用組織剪迅速剪斷，置入4%多聚甲醛固定液中，固定12～24 小時(shí)。

2、組織脫水

將陰莖從固定液中取出后擦干，依次置入70%、80%，90%、95%酒精中各2 小時(shí)，再置入100%酒精I(xiàn)和Ⅱ中各1 小時(shí)。

3、透明、包埋及切片

將脫完水的陰莖組織置入二甲苯中透明，透明時(shí)間根據(jù)組織的透明程度而定，大約是30 min。透明完畢后置入浸蠟，溫箱中過(guò)夜，次日進(jìn)行包埋。修好蠟塊后，將陰莖組織按照陰莖頭部、中部及根部進(jìn)行切片，切片厚度為5 μm，用涂抹了自制防脫液的載玻片撈取已展平的組織切片。

4、免疫組化染色

切片脫蠟至水，熱抗原修復(fù)10 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗5min×3 次，擦干；滴 加3%H2O2，PBS 沖 洗5min×3 次，滴 加 封 閉 血 清15min，甩干；滴加兔抗大鼠α-actin 抗體(1：50)，室溫孵育4 h，PBS 沖洗5min×3 次；滴加山羊抗兔二抗15 min，PBS 沖洗5min×3 次，擦干； 滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，蒸餾水沖洗中止顯色；蘇木素復(fù)染，脫水至二甲苯，樹(shù)膠封片。

5、圖像的采集和分析

免疫組化染色的圖像分析利用彩色圖文分析系統(tǒng)，由從事病理專業(yè)大于5年的醫(yī)師進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)測(cè)量，分別測(cè)量陰莖頭部、中部及近根部組織切片中α-actin 陽(yáng)性區(qū)域百分比 （positive area percentage,PAP）,PAP 代表平滑肌細(xì)胞的含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單樣本K-S 檢驗(yàn)驗(yàn)證兩組大鼠的SWQ、PAP 是否符合正態(tài)分布，利用Levene 方差齊性檢驗(yàn)分析兩組大鼠的SWQ 和PAP 方差是否相等。如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組大鼠SWQ 之間的差異和PAP 之間的差異，如果樣本不符合正態(tài)分布或方差不齊，則使用Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SWE 檢查

所有大鼠均成功完成陰莖組織的SWE 成像及SWQ 測(cè)量（圖1），灰階超聲圖像顯示陰莖橫切面呈圓形，邊界清晰，包膜完整，內(nèi)部為均勻低回聲，SWE 圖像顯示陰莖組織內(nèi)色彩充填完整、呈油畫(huà)樣，無(wú)馬賽克樣斑點(diǎn)。

低年齡組及高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 均符合正態(tài)分布（P=0.200），但兩組方差不齊（P=0.011）。低年齡組大鼠陰莖組織SWQ 為（9.75±1.06）kPa，高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 為（8.45±1.85）kPa，高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 明顯低于低年齡組（P=0.001）。

圖1 大鼠陰莖SWE 圖像

二、平滑肌細(xì)胞含量

圖2 顯示兩組大鼠陰莖組織α-actin 的表達(dá)情況，低年齡組大鼠平滑肌稀疏，染色淺淡，高年齡組大鼠平滑肌則較為密集，著色較深。

低年齡組陰莖組織PAP 符合正態(tài)分布（P=0.200），高年齡組陰莖組織PAP 不符合正態(tài)分布（P=0.035），兩組方差不齊（P<0.001）。低年齡組大鼠陰莖組織PAP 為（3.56±0.92）%，高年齡組大鼠陰莖組織PAP 為（17.54±8.24）%，高年齡組大鼠陰莖組織PAP 明顯高于低年齡組（P<0.001）。

圖2 兩組大鼠陰莖組織α-actin 表達(dá)情況

討 論

陰莖海綿體主要有兩種細(xì)胞構(gòu)成，即平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；其中平滑肌細(xì)胞約占40-52%[1]，是海綿體舒張的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，膠原纖維細(xì)胞構(gòu)成海綿體的纖維支架結(jié)構(gòu)，維持海綿體硬度，防止陰莖變形、彎曲[9]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，陰莖勃起的基本機(jī)制是：在性刺激下，平滑肌舒張，海綿體組織充血腫脹，海綿體內(nèi)壓逐漸升高，同時(shí)白膜下靜脈受壓，回流血量逐漸減少，當(dāng)海綿體內(nèi)壓足夠大時(shí)，陰莖動(dòng)脈血流流入停止，陰莖白膜下靜脈受壓而沒(méi)有血流流出，陰莖處于一個(gè)完全閉合的狀態(tài)，達(dá)到完全勃起。因此，平滑肌的含量直接影響勃起功能，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)陰莖組織內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量至關(guān)重要。

目前，臨床準(zhǔn)確評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌含量的唯一方法是活檢獲取陰莖組織樣本并通過(guò)免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞定量，免疫組化染色進(jìn)行陰莖組織平滑肌細(xì)胞含量的定量分析機(jī)制如下： 陰莖組織中平滑肌主要有海綿體平滑肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞兩種類型，以海綿體平滑肌細(xì)胞為主，海綿體平滑肌細(xì)胞具有收縮功能，含有α-actin，α-actin 抗體可以作為定量海綿體平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物。該方法取材操作時(shí)技術(shù)要求高，且為有創(chuàng)檢查，術(shù)后易造成陰莖疼痛、陰莖硬結(jié)等副作用，患者難以接受，實(shí)際臨床應(yīng)用受到了極大限制，探索一種無(wú)創(chuàng)評(píng)價(jià)活體陰莖組織平滑肌細(xì)胞含量的方法具有重要的臨床意義。

目前，超聲影像是陰莖組織首選的臨床影像學(xué)檢查方法，但是，常規(guī)超聲檢查（灰階和多普勒）尚不能評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌細(xì)胞的含量。SWE 是一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)的新型超聲定量檢查技術(shù)，該技術(shù)成像原理與常規(guī)B 型超聲不同：B 型超聲主要獲取和顯示病變的形態(tài)學(xué)信息和特征，SWE 基本原理是利用探頭發(fā)射聲輻射力脈沖，在組織不同深度上連續(xù)聚焦，被聚焦部位組織粒子高效振動(dòng)并產(chǎn)生橫向剪切波，成像系統(tǒng)可以精確檢測(cè)出感興趣區(qū)組織中各個(gè)質(zhì)點(diǎn)的橫向剪切波的速度（SWV）并進(jìn)行實(shí)時(shí)成像和推算出感興趣區(qū)組織的彈性量化測(cè)值（SWQ）。由于感興趣區(qū)組織中細(xì)胞種類及含量直接影響SWV，因此從理論上講，SWQ 測(cè)值可以反映出被測(cè)組織的細(xì)胞種類及含量的改變。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展SWE 技術(shù)的相關(guān)研究，初步發(fā)現(xiàn)，SWE 技術(shù)在診斷陰莖硬結(jié)癥、勃起功能障礙方面具有獨(dú)特的價(jià)值[5-8]。據(jù)此，作者希望通過(guò)本研究證實(shí)：利用SWE 技術(shù)可以定量評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌含量的改變。

陰莖組織平滑肌的含量與年齡密切相關(guān)，正常生理?xiàng)l件下，不同年齡階段的陰莖組織平滑肌含量不同，故我們選取不同年齡組的大鼠進(jìn)行研究。本研究選取α-actin 抗體進(jìn)行陰莖組織的免疫組化染色分析，定量測(cè)定陰莖組織平滑肌含量，并以此作為“金標(biāo)準(zhǔn)”；同時(shí),利用SWE 觀測(cè)大鼠陰莖組織的SWQ，結(jié)果顯示：低年齡組和高年齡組大鼠陰莖組織平滑肌含量存在顯著差異，兩組大鼠陰莖組織的SWQ 也存在顯著性差異。這一研究結(jié)果提示：SWQ 可以作為一項(xiàng)定量分析陰莖組織平滑肌含量的新指標(biāo)，SWE 有望成為一種評(píng)價(jià)陰莖組織平滑肌含量的無(wú)創(chuàng)新方法，值得進(jìn)一步研究。