李 銳 曹全富 綜述 張慶華 劉 威 審校

1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（重慶 400042）2. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室（重慶 400038）

熱休克蛋白是一類非常保守的蛋白質(zhì)，其主要功能是緩沖各種環(huán)境有害因素可能對細胞造成的不利影響。它們主要行使分子伴侶或伴侶輔助分子的功能，負責(zé)輔助完成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、穩(wěn)定、折疊、轉(zhuǎn)運和降解，以及蛋白復(fù)合體的組裝與維系。分子量70 kDa 的熱休克蛋白(heat shock protein 70，HSP70)是數(shù)量最豐富、進化最保守的熱休克蛋白家族之一，在人類基因組中至少含有13 個編碼基因[1,2]。

精子發(fā)生是從精原細胞到精子的發(fā)育過程，此過程得以正常進行，部分歸功于熱休克蛋白。精子發(fā)生完成時，精子在結(jié)構(gòu)上已發(fā)育成熟，但此時尚不具備完整的生物學(xué)功能，還需進行功能轉(zhuǎn)化，其主要體現(xiàn)為精子結(jié)構(gòu)重塑及其功能改變，這種功能轉(zhuǎn)化不僅發(fā)生于男性生殖道中（主要是附睪），還發(fā)生于精子在女性生殖道內(nèi)獲能的過程中，最終產(chǎn)生功能成熟的精子，而此過程也與HSP 有關(guān)。本文重點講述HSPA2，這是一種在睪丸中大量表達的HSP70 家族成員，以前的名稱為HSP70.2。它的功能就是促進胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和運輸，以及蛋白復(fù)合體的組裝,其表達水平與體外受精能力呈正相關(guān)。本文從HSPA2 的分子特征和活性機制、HSPA2 在男性精子發(fā)生和功能成熟中的作用、 以及HSPA2 在氧化壓力下發(fā)生4- 羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4HNE) 修飾等幾個方面進行綜述，以期為HSPA2 的進一步研究提供理論指導(dǎo)。

一、HSPA2 的分子特征和活性機制

HSP70 家族成員具有一個共同的、 高度保守的模塊化結(jié)構(gòu)，包括一個N 端的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain，NBD)，也稱ATP 酶結(jié)構(gòu)域，一個位于中心的連接區(qū)域，以及位于C 端內(nèi)的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(substrate-binding domain，SBD)。與所有HSP70一樣，HSPA2 內(nèi)的NBD 和SBD 通過一段保守的疏水序列連接(圖1A)。在結(jié)構(gòu)上，NBD 包括兩個亞結(jié)構(gòu)域，核苷酸即結(jié)合于兩者之間的縫隙中。該結(jié)構(gòu)域與ATP有很強的親和力，一旦結(jié)合，就可以通過水解ATP 所提供的能量來驅(qū)動其構(gòu)象改變(圖1B)。SBD 由一個β 夾心子域SBD-（β）和一個α 螺旋蓋區(qū)SBD-（α）組成。(圖1A)。SBD 是結(jié)合底物的關(guān)鍵區(qū)域，其能夠與5-7 個疏水氨基酸所組成的肽段相結(jié)合。

圖1 HSPA2 的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)周期

HSPA2 依賴NBD 的ATP 酶活性來調(diào)節(jié)底物的結(jié)合和釋放。當(dāng)ATP 與NBD 結(jié)合時，HSP70 的構(gòu)象呈現(xiàn)“開放狀態(tài)”，表現(xiàn)出低底物親和力(圖1B 下)，此構(gòu)象可穩(wěn)定新生或變性蛋白，防止這些未折疊多肽的聚集。當(dāng)ATP水解成ADP 時，會形成“封閉狀態(tài)”的高親和力構(gòu)象(圖1B 上)，此構(gòu)象可引發(fā)蛋白質(zhì)折疊(與伴侶輔助分子一起)，多聚體復(fù)合物的形成，以及目標(biāo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運。整個反應(yīng)周期在HSP70 家族的大多數(shù)成員中以類似方式進行。

二、HSPA2 在男性精子發(fā)生中的作用

基于小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，HSPA2 最早出現(xiàn)于生精細胞第一次減數(shù)分裂早期（細線期-偶線期）。被選擇性敲除hspa2 基因的雄性小鼠其生精細胞在第一次減數(shù)分裂的G2-M 階段受阻，在粗線期經(jīng)凋亡被清除，最終引發(fā)不育。目前認為HSPA2 在小鼠生精細胞中有兩個主要功能，第一HSPA2 似乎促進細胞周期蛋白依賴性激酶2 與細胞周期調(diào)控蛋白B1 之間的相互作用，第二其作為聯(lián)會復(fù)合體的“調(diào)節(jié)器”在同源染色體之間介導(dǎo)染色體配對、聯(lián)會和減數(shù)分裂重組事件。除了支持減數(shù)分裂外，HSPA2 還在減數(shù)分裂后輔助過渡蛋白完成特定的功能[3]。一項基于大鼠的研究表明，在精子頂體形成過程中胞質(zhì)中的HSPA2 被募集到高爾基體中[4]，但其功能尚不明確，有待進一步研究。

HSPA2 在人類精子發(fā)生過程中似乎以雙相模式進行表達。該蛋白第一次表達始于精母細胞，推測其支持減數(shù)分裂。盡管沒有足夠證據(jù)支持人類HSPA2 如小鼠研究中所報道的即在調(diào)節(jié)聯(lián)會復(fù)合體或輔助細胞周期蛋白- 周期蛋白依賴性激酶復(fù)合體的過程中發(fā)揮類似作用，但大量數(shù)據(jù)顯示HSPA2 在睪丸中的表達水平與射精精子濃度之間存在著很強的相關(guān)性。據(jù)報道，在患有少精子癥、 精母細胞發(fā)育停滯或唯支持細胞綜合征所導(dǎo)致的完全非梗阻性無精子癥 （即射精時沒有可檢測的精子）的不育患者中，HSPA2 表達水平顯著降低[5]。此外，人類和小鼠HSPA2 同源物的氨基酸序列保守程度超過98%，有研究指出HSPA2 在精子發(fā)生方面很可能具有保守的功能。其第二次表達在長形精子細胞形成過程中開始[6]，既往研究表明HSPA2 在此階段參與細胞質(zhì)擠壓和質(zhì)膜重構(gòu)[7,8]，HSPA2 表達水平下降會導(dǎo)致精子細胞質(zhì)保留過多[7]。

總之，HSPA2 可以依賴其分子伴侶活性在精子發(fā)生的不同階段發(fā)揮特定功能，是精子發(fā)生得以正常進行的必要因素。

三、HSPA2 在男性精子成熟中的作用

大量研究表明HSPA2 對精子的功能轉(zhuǎn)化 （成熟）至關(guān)重要，一個直接證據(jù)是，HSPA2 被發(fā)現(xiàn)定位于人類成熟精子頂體表面，這一位置與精卵相互識別、相互作用的位置一致[9]。另有研究指出，弱精子癥患者精子中HSPA2 表達水平升高[10]，精漿中游離的HSPA2 也與正常人群存在顯著差異，并且與精子活力呈負相關(guān)[11]。目前認為HSPA2 可促進并維系精子表面卵透明帶（zona pellucida,ZP）識別復(fù)合物（也稱ZP 受體）的組裝、重定位和暴露[9,12,13]。

在正常精子中HSPA2 與一些蛋白多聚體存在穩(wěn)定的相互作用[9,14-16]，目前已發(fā)現(xiàn)人類精子蛋白質(zhì)組中有幾個潛在的HSPA2 結(jié)合底物[9,14,15]，其中研究最深入的是精子粘附分子1 （sperm adhesion molecule 1,SPAM1）和芳香基硫酸酯酶A(arylsulfatase A,ARSA)。HSPA2 與SPAM1 和ARSA組成的復(fù)合物似乎經(jīng)歷了一個與精子獲能相關(guān)的結(jié)構(gòu)重塑過程。ARSA 發(fā)生重定位而易于被精子細胞膜表面抗體所標(biāo)記，與之相反SPAM1 重定位后在精子細胞膜表面含量下降。ARSA與SPAM1 的這種結(jié)構(gòu)重塑還與精子在獲能晚期失去結(jié)合透明質(zhì)酸的能力相一致[17]。值得注意的是，重定位后ARSA 所在位置正好與卵透明帶相互作用相適應(yīng)，而SPAM1 主要在精卵識別之前參與精子穿越卵丘基質(zhì)的過程[9]。HSPA2 也能與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE) 和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A6 (protein disulphide isomerase A6 ,PDIA6)形成穩(wěn)定復(fù)合物[15]。只有當(dāng)精子處于獲能狀態(tài)時，PDIA6 才能在精子表面被標(biāo)記，而ACE 卻無法被標(biāo)記。另一方面，通過藥物抑制ACE 后，精子誘發(fā)頂體反應(yīng)的能力顯著降低，說明HSPA2 所介導(dǎo)的PDIA6-ACE 復(fù)合物對于受精能力極其重要[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，HSPA2 與伴侶輔助蛋白(BCL2-associated athanogene 6,BAG6)及解整合素樣金屬蛋白酶 (A Disintegrin And Metalloproteinase Domain 30,ADAM30)也可形成穩(wěn)定的復(fù)合物，該復(fù)合物位于精子頭部頂端區(qū)域。推測BAG6 對于由HSPA2所介導(dǎo)的精子ZP 受體復(fù)合物的裝配有所幫助，可防止發(fā)生蛋白質(zhì)錯誤折疊或錯誤定位。在因精卵結(jié)合障礙而導(dǎo)致不育的患者中，不僅HSPA2 表達水平下降，BAG6 的蛋白表達也嚴重降低[14]。

盡管當(dāng)前精子表面發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑的分子機制還知之甚少，但已發(fā)現(xiàn)HSPA2 復(fù)合體似乎與膜筏的結(jié)構(gòu)標(biāo)記物共定位，而膜筏是精子頭部獲能過程中重定位的微區(qū)（microdomain）[12]。研究顯示，由精子獲能驅(qū)動的HSPA2 翻譯后修飾對于這種結(jié)構(gòu)重塑至關(guān)重要，成熟精子經(jīng)過廣譜酪氨酸激酶抑制之后，與HSPA2 相關(guān)的重定位將不再發(fā)生[13]。另有研究報導(dǎo)，成熟精子暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境也會破壞HSPA2 所介導(dǎo)的精子表面結(jié)構(gòu)重塑[18]。

此外，HSPA2 表達水平下降可導(dǎo)致不成熟精子產(chǎn)生[19]，主要表現(xiàn)為精子在受精過程中結(jié)合ZP 的能力明顯降低，最終導(dǎo)致受精失敗[8,19]。最近一項比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究也證實，在精卵識別障礙的不育患者精子中，HSPA2 表達水平明顯不足[9]。盡管此項研究未能將HSPA2 缺陷與精子活力或形態(tài)方面的缺陷聯(lián)系起來，但這一證據(jù)顯示HSPA2 對精子發(fā)生完成后的功能成熟極其重要[20]。

總之，這些實驗結(jié)果表明HSPA2 很可能通過與多種ZP 受體關(guān)鍵蛋白分子形成復(fù)合物，穩(wěn)定它們在精子表面的取向與定位，從而在精子獲能、精卵識別、及精子穿越卵丘基質(zhì)與透明帶等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

四、 HSPA2 功能障礙與4- 羥基壬烯醛（4HNE）修飾

一個值得關(guān)注的問題是，部分男性不育患者精子中HSPA2 的功能障礙是如何發(fā)生的？ 盡管與此相關(guān)的研究有很多，但目前主流的研究模型集中在氧化應(yīng)激的影響上。氧化應(yīng)激可通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化級聯(lián)反應(yīng)，形成一系列小分子量的醛類化合物，4- 羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4HNE)是其中常見的一種。研究表明，4HNE 所造成的HSPA2 化學(xué)修飾可能損害其分子伴侶活性，并進一步造成精子質(zhì)膜重構(gòu)異常[18]。此外，這種修飾不僅會影響HSPA2/SPAM1/ARSA 受體復(fù)合物的組裝與維系，也會影響上述HSPA2/PDIA6/ACE 復(fù)合物[15,18]。另有研究表明，4HNE 加合會優(yōu)先靶向半胱氨酸、賴氨酸和組氨酸殘基，從而引發(fā)一系列結(jié)構(gòu)和功能變化，包括底物識別能力的喪失或重折疊能力的喪失[21-25]。已有明確生化實驗證實，4HNE 可以共價修飾HSPA2 分子NBD 內(nèi)的Cys267 殘基[26]，從而減弱HSPA2的ATP 酶活性，并阻止其在蛋白質(zhì)運輸和重折疊事件中發(fā)揮作用[26,27]。共價修飾的HSPA2 很可能通過蛋白酶體途徑降解[28]，此外，4HNE 還可能通過增強細胞蛋白酶體活性而加速細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的水解[29]。但有爭議的是，較高濃度的4HNE 可以極大促使蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而導(dǎo)致蛋白酶體失活[30,31]。另有報道稱，4HNE 修飾可經(jīng)溶酶體途徑介導(dǎo)蛋白降解[32]?？傊谶@些實驗數(shù)據(jù)可以推測患病群體精子發(fā)育過程中HSPA2 水平下降很可能與4HNE 修飾所致的蛋白質(zhì)降解有關(guān)。此外，在BAG6 缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸中，HSPA2 的保護性伴侶分子BAG6 被敲除后，HSPA2 蛋白水解速度也隨之加快[33]，這可以作為上述推測的一個佐證。

五、總結(jié)

HSPA2 表達水平、 結(jié)構(gòu)完整性與功能狀態(tài)直接關(guān)系到精子發(fā)生、成熟、獲能及精卵識別等過程，從而決定最終能否成功受精。從此意義來說，HSPA2 很有可能成為臨床上評判男性生育力的生物標(biāo)志物。然而，目前關(guān)于HSPA2 的表達調(diào)控、作用機制與環(huán)境壓力下活性喪失的研究還很不充分。綜合已有研究成果來看，HSPA2 可在兩個階段發(fā)揮重要作用，一是精子發(fā)生過程中維系減數(shù)分裂復(fù)合物，二是精子功能轉(zhuǎn)化（成熟）過程中促進精子頂體表面ZP 受體復(fù)合物的組裝、定位與穩(wěn)定，從而保證精卵的正確識別。與此相應(yīng)，HSPA2的表達也經(jīng)歷了兩次高潮。另一方面，環(huán)境因素如氧化壓力既可通過影響DNA 甲基化而造成HSPA2 的轉(zhuǎn)錄抑制，從而造成HSPA2 表達水平下降，也可通過共價修飾造成HSPA2 三維結(jié)構(gòu)改變，進而導(dǎo)致其活性喪失。但目前為止還有很多問題尚不明確，解決這些問題將對不育癥的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。