刁翰林，徐 麗，程文秀，郁 悅，陳思儒，丁 楠，師 偉

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014； 2. 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021； 3. 東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014)

肛瘺(anal fistula，AF)近年發(fā)病率持續(xù)增高約4倍[1]，手術(shù)是其常規(guī)治療手段。但是由于AF位置特殊，手術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢與疼痛成為臨床常見問題。課題組前期研究證明，以中藥外洗、電針刺激和耳穴壓豆為主的中醫(yī)綜合外治法，可明顯加快AF術(shù)后患者創(chuàng)面的愈合速度，促進(jìn)VEGF、bFGF表達(dá)，提高患者血清P物質(zhì)(substance p，SP)含量[2]。而速激肽1型受體(NKIR)是目前公認(rèn)SP最敏感的受體。有研究表明，上調(diào)SP/NK1R可減少炎癥反應(yīng)[3]，促進(jìn)VEGF與FGF-2釋放[4-5]，加速血管修復(fù)與生成，對創(chuàng)面愈合起到促進(jìn)作用?；谇捌诠ぷ?，本實(shí)驗(yàn)就中醫(yī)綜合外治法促進(jìn)AF術(shù)后創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制展開實(shí)驗(yàn)探索，以為臨床提供新的思路與手段。

1 材料與方法

1.1 分組、造模及干預(yù)方法

1.1.1 動物與分組 選取12周齡、體質(zhì)量(220±20)g的SD雄性大鼠共30只(動物批準(zhǔn)號37009200007764)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為中醫(yī)綜合外治組(治療組)、口服曲馬多組(對照組)和模型組(空白組)，并分別編號、稱重，每日自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 飼養(yǎng)及造模方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照何永恒[6]等造模方法，將大鼠麻醉并待肛門松弛后，以肛緣為界，切開皮膚至直腸黏膜，創(chuàng)面修剪為三角形缺損(底寬1 cm，高2 cm)，損傷深度達(dá)肛門括約肌。

1.1.3 干預(yù)措施 圖1示，各組大鼠俯臥位固定，以醫(yī)用棉簽蘸取碘伏溶液，反復(fù)擦拭創(chuàng)面5次至局部滲血，造成大鼠肛周創(chuàng)面的模擬臨床換藥刺激，每日1次。其中對照組于換藥刺激前1 h給予3.25%鹽酸曲馬多溶液2 ml灌胃；治療組于換藥刺激前5 min給予免煎中藥湯劑活血止痛散外洗，以完全浸透藥液的2×2×2 cm醫(yī)用棉球，控制藥液溫度45 ℃，將棉球緊敷于大鼠肛門創(chuàng)面并以多層厚紗布固定約5 min。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7-8]等文獻(xiàn)定穴原則，選定大鼠長強(qiáng)穴、次髎穴，于換藥刺激時(shí)使用韓氏穴位神經(jīng)刺激儀將針灸毫針刺入穴位，給予經(jīng)皮穴位電刺激操作，頻率2 Hz，起始強(qiáng)度1 mA，持續(xù)5 min。后根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》耳穴定位原則，以人耳穴定位類比大鼠耳穴定位，取肛門穴、直腸穴、交感穴，用棉簽棒按壓模擬耳穴壓豆刺激；空白組不給予干預(yù)措施。

圖1 耳穴位置示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物及手術(shù)器械 活血止痛散(魯藥制字Z2012003195)，按照同等劑量轉(zhuǎn)換為規(guī)范中藥免煎顆粒劑型(江陰天江藥業(yè)有限公司)。藥物組成：乳香15 g，沒藥15 g，赤芍20 g，制大黃30 g，五倍子15 g，白芷15 g，馬齒莧30 g，元胡15 g，蒲公英30 g。鹽酸曲馬多片、碘伏等由山東大學(xué)省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動物房提供。手術(shù)器械(組織剪、眼科剪、組織鑷)、無菌棉球、生理鹽水、福爾馬林、麻醉藥品等，由山東大學(xué)省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動物房提供。

1.2.2 試劑與試劑盒 Western Blot相關(guān)試劑：蛋白質(zhì)提取試劑盒、SDS-PAGE濃縮膠試劑盒、顯影液及定影液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)抗體購自Affinity公司；其余試劑均由山東大學(xué)省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。ELIDA相關(guān)試劑：白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司。PCR相關(guān)試劑：成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、神經(jīng)肽P物質(zhì)mRNA(SPmRNA)、NK1RmRNA引物購自上海博尚生物科技有限公司(引物序列見表1)，總RNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、快速定量PCR試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司。

表1 引物名稱序列

1.3 取材及保存

造模后常規(guī)飼養(yǎng)10 d，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛常規(guī)消毒、鋪巾，心臟灌流處死，取大鼠創(chuàng)面組織立即置于液氮中暫存，于-80 ℃中長期保存。另取部分創(chuàng)面組織立即投入Trizol中，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并將提取液及組織置于-80 ℃中保存。

1.4 檢測指標(biāo)及步驟

1.4.1 Western Blot法檢測創(chuàng)面組織VEGF、bFGF及操作步驟 將創(chuàng)面組織置于勻漿器中于冰上研磨，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)提取與濃度測定，加25%體積5×loading buffer后金屬浴變性10 min，配置濃度10%的濃縮膠，按照30 V 60 min、80 V 90 min進(jìn)行電泳，100 V 40 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次10 min，一抗4 ℃搖床孵育過夜；第2天取出，TBST洗膜3次10 min，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次10 min，于暗室顯影。

1.4.2 ELIDA法檢測創(chuàng)面組織IL-1、IL-6、TNF-α及操作步驟 取組織勻漿，嚴(yán)格按照說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書操作方法梯度稀釋后，另取待測樣品孔加樣10 μl并設(shè)空白孔，后于每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μl(空白孔除外)，封板膜封板并置37 ℃恒溫箱溫育 30 min，每孔加滿洗滌液靜置 30 s棄去，重復(fù)洗滌 5 次拍干，先后加入顯色劑A、B各50 μl，37 ℃避光顯色10 min，加終止液 50 μl，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度，將結(jié)果帶入回歸曲線進(jìn)行濃度計(jì)算。

1.4.3 PCR法檢測bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA及操作步驟 取100 mg左右組織加入裂解液RZ 1 ml，嚴(yán)格按試劑說明書操作步驟進(jìn)行總RNA提取，并檢測樣本RNA的純度與濃度；設(shè)置反應(yīng)體系10 μL置于eppendorf儀，以37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min、70 ℃ 10 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，離心3 min后按照95 ℃ 1 s高溫預(yù)變性，按95 ℃ 5 s、58 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，循環(huán)45次進(jìn)行RNA擴(kuò)增，上機(jī)進(jìn)行mRNA定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠創(chuàng)面愈合情況

圖2～4示，各組干預(yù)治療10 d后觀察創(chuàng)面愈合情況。淺色橢圓內(nèi)為造模位置即創(chuàng)面位置。實(shí)驗(yàn)組與對照組創(chuàng)面均紅潤，有新鮮肉芽組織生長，其中實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面干燥，愈合良好，無炎性滲出物；對照組創(chuàng)面較干燥、愈合較好，可見極少量炎性滲出物，治療效果較實(shí)驗(yàn)組稍差；空白組創(chuàng)面濕潤，可見肉芽水腫，有較多炎性滲出物(如深色橢圓所示位置)，愈合較差。

圖2 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面

圖3 對照組創(chuàng)面

圖4 空白組創(chuàng)面

圖5 Western Blot條帶

2.2 Western Blot法結(jié)果

圖5表2示,在bFGF方面與空白組比較，對照組與治療組bFGF含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對照組比較，治療組bFGF升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在VEGF方面，對照組與空白組比較，VEGF含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組與空白組和對照組比較，VEGF含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 ELIDA法結(jié)果

表3示，在IL-1與IL-6方面，對照組與空白組、治療組與空白組、治療組與對照組比較，IL-1與IL-6含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在TNF-α方面，對照組與空白組、治療組與空白組比較，TNF-α含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 bFGF、VEGF相對灰度值比較

表3 ELIDA法檢測IL-1、IL-6、TNF-α 結(jié)果比較

2.4 PCR法結(jié)果

表4示，在bFGFmRNA方面與空白組比較，對照組與治療組bFGFmRNA含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組與對照組比較，bFGFmRNA升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果與Western Blot一致。在SPmRNA方面，對照組與空白組比較、治療組與空白組比較、治療組與對照組比較，SPmRNA含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在NK1RmRNA方面，對照組與空白組比較、治療組與空白組比較、治療組與對照組比較，NK1RmRNA含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表4 PCR法檢測bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA結(jié)果比較

3 討論

肛瘺術(shù)后屬于中醫(yī)學(xué)“金刃所傷”范疇，“脈絡(luò)崩斷”是其直接病機(jī)，基本治法為化瘀通絡(luò)、理氣止痛、收斂生肌[9]。現(xiàn)在大量文獻(xiàn)報(bào)道，中藥內(nèi)服、中藥熏洗、針灸與耳穴壓豆可有效促進(jìn)患者術(shù)后創(chuàng)面愈合[10]。本實(shí)驗(yàn)所采用的外洗方劑活血止痛散，方中乳香、沒藥、五倍子可行氣止痛、消腫生肌，配伍元胡、馬齒莧可加強(qiáng)止痛作用，赤芍、大黃、白芷與蒲公英清熱涼血兼具解毒消腫，全方具有活血解毒、化瘀通絡(luò)的功效。針刺長強(qiáng)穴與次髎穴可清熱通便，活血化瘀，配合活血止痛散外洗，可以增強(qiáng)去腐生肌、活血止痛的作用。肛門穴、直腸穴和交感穴是肛瘺術(shù)后耳穴壓豆的常用穴[11]，與湯藥外洗、電針刺激相輔相成，三法并用加強(qiáng)止痛促愈效果。課題組前期證實(shí)[2]，活血止痛散湯劑外洗、電針刺激與耳穴壓豆等中醫(yī)綜合外治法可明顯提高AF術(shù)后患者創(chuàng)面愈合速度，降低創(chuàng)面肉芽組織生長的形態(tài)異常率。

研究表明，VEGF高表達(dá)，特異性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶，從而激活其下游的相關(guān)基因表達(dá)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖及遷移，誘導(dǎo)間質(zhì)膠原酶的表達(dá)[12]，最終形成新生血管，對全身各組織血管的生長、增殖與遷移有顯著效果[14]，促進(jìn)肉芽組織及其血管內(nèi)皮細(xì)胞與毛細(xì)血管的生長促進(jìn)創(chuàng)面愈合[15]；bFGF可特異結(jié)合其具有酪氨酸激酶活性的受體激活PI3K/Akt通路[15-16]，使活化的Akt轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)進(jìn)一步活化下游靶點(diǎn)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖[17]，并與VEGF在創(chuàng)面愈合協(xié)同作用，加強(qiáng)止血與血管生成，共同促進(jìn)創(chuàng)面愈合[18]。IL-1、IL-6和TNF -α作為炎癥因子，可以加速炎癥介質(zhì)的釋放，引起組織損傷，并與創(chuàng)傷程度成正相關(guān)[19]，可在一定程度上反映創(chuàng)面愈合速度。有實(shí)驗(yàn)證明，SP可以促進(jìn)血管生成與創(chuàng)面愈合，降低炎癥因子的表達(dá)[20-21]，應(yīng)用NK1R拮抗劑又可延遲傷口愈合速度，加重炎癥反應(yīng)[22]，故而推測上調(diào)SP/NK1R通路加速血管生成參與創(chuàng)面愈合，可能與促進(jìn)VEGF、bFGF及降低炎癥因子釋放有關(guān)。SP作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮止痛作用，于中腦PAG區(qū)促進(jìn)內(nèi)啡肽釋放，同時(shí)SP在周圍神經(jīng)系統(tǒng)又可傳遞痛覺信息[23-24]；SP/NK1R高表達(dá)又可激活中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的下行抑制系統(tǒng)[25]，通過調(diào)節(jié)5-羥色胺表達(dá)[26],平衡自感覺神經(jīng)傳入的傷害性疼痛電信號[27]，減弱痛覺自下而上的傳遞，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合因子釋放的同時(shí)，抑制痛覺中樞興奮，從而發(fā)揮止痛與促愈的雙重效果。

炎性浸潤是創(chuàng)面修復(fù)過程的啟動環(huán)節(jié)，新血管生成是肉芽組織形成的重要標(biāo)志，二者均可反映創(chuàng)面愈合情況。在本實(shí)驗(yàn)中，治療組與對照組的bFGF與VEGF均升高，IL-1、IL-6與TNF-α均降低，提示中醫(yī)綜合外治法可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織的血管平滑肌細(xì)胞生長與毛細(xì)血管生成，并降低炎癥反應(yīng)，提高創(chuàng)面愈合速度，總體上中醫(yī)綜合外治法效果更好。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，該2組大鼠SPmRNA與NK1RmRNA含量均升高，結(jié)合前文所述，提示中醫(yī)綜合外治法可通過上調(diào)SP/NK1R通路來參與肛瘺術(shù)后創(chuàng)面促愈過程。

綜上所述，湯劑外洗、電針刺激和耳穴壓豆刺激的中醫(yī)綜合治法可提高肛瘺術(shù)后模型大鼠的創(chuàng)面愈合速度，并可通過上調(diào)SP/NK1R關(guān)鍵通路來促進(jìn)bFGF與VEGF表達(dá)，抑制IL-1、IL-6與TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)局部血管生成，降低炎癥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。在減少抗生素使用、降低醫(yī)院藥物占比與促進(jìn)肛瘺術(shù)后患者創(chuàng)面愈合方面，本實(shí)驗(yàn)可提供新的手段與思路。