王 茜萬 靜譚揚茗羅丹丹熊海英姜 紅

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院兒科,武漢 430014)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是兒科各個年齡組最常見的潛在的危害性最大的疾病之一,急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種病理生理過程,目前研究發(fā)現(xiàn)ALI的發(fā)病機制主要由炎癥反應(yīng)/抗炎反應(yīng)的失衡造成,其發(fā)病率及病死率極高[1]。內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起ALI的重要因素之一,研究表明,LPS可刺激缺氧誘導(dǎo)因子1-α(hypoxia inducible factoR-1α,HIF-1α)的聚集[2],通過增加其轉(zhuǎn)錄與蛋白翻譯,抑制蛋白降解[3],HIF-1α可進一步激活其靶基因血管內(nèi)皮生長因子,共同參與炎癥性肺損傷的病理過程[4]。Toll受體4(toll-like receptor 4,TLR4)作為Toll家族的一員,已被確認為LPS的模式識別受體[5]。研究表明,TLR4可通過髓系分化因子88(MyD88)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信號通路,誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[6]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、改善心肌缺血、抗病毒等作用[7-12]。另外,黃芪在治療急性肺損傷方面也發(fā)揮重要作用[13-15]。本研究以SD大鼠為研究對象,利用LPS誘導(dǎo)幼鼠急性肺損傷模型,以地塞米松為陽性藥做對照,觀察黃芪甲苷對急性肺損傷模型(幼鼠)TLR4-p38 MAPKs信號通路的影響,以期闡明黃芪甲苷在幼鼠急性肺損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF(specific pathogen free)級健康SD雌性孕鼠6只,體重200～220 g,購自湖北省疾控中心[SCXK(鄂)2015-0018]。于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動物模型研究院SPF條件下飼養(yǎng)[SYXK(鄂)2018-0104]。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22℃～26℃,相對濕度50%～60%,人工光照明暗各12 h,給予標準飼料和純凈水喂養(yǎng)。新生仔鼠母乳喂養(yǎng)至第7天隨機分為4組,每組6只。本實驗經(jīng)武漢華聯(lián)科有限公司模型動物研究院倫理審查委員會審查批準(HLK-20190303-01)。實驗過程中對實驗鼠的處置符合中華人民共和國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》的規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪甲苷溶液配制：取黃芪甲苷干粉溶解于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中,制成0.3 mg/mL的黃芪甲苷混懸液備用。地塞米松溶液配制：用蒸餾水將地塞米松配制成0.5 mg/mL溶液備用。

TLR4 抗體、P-38 抗體、p-p38、RIPA(強)組織細胞快速裂解液,BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、蘇木素、伊紅購自bioswamp公司,貨號分別為：PAB33926、 PAB40560、 PAB43320-P、 W1689、W1712、I1709、I1703;黃芪甲苷、地塞米松、羧甲基纖維素鈉購自 aladdin公司,貨號分別為：A111275、D137736、C104979;LPS、戊巴比妥鈉購自 sigma公司,貨號分別為：L3012、P3761;SYBR Green PCR 試劑盒購自 KAPABiosystems公司,貨號：KM4101;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司,貨號：639505。

電泳儀、熒光定量PCR儀,美國BIO-RAD公司,型號分別為：mini protean 3 cell、CFX-Connect 96;酶標儀,芬蘭雷勃公司,型號：MK3;全自動化學發(fā)光分析儀,上海天能科技有限公司,型號：TanoN-5200;凝膠成像系統(tǒng)北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;正置顯微鏡、石蠟切片機,德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司,型號分別為：DM1000、TKD-TK;組織脫水機、石蠟包埋機,湖北康強醫(yī)療器械有限公司,型號：TKD-TSB、Tb-718D。

1.3 實驗方法

1.3.1 新生小鼠肺損傷模型構(gòu)建

新生7 d小鼠稱重,腹腔注射LPS(5 mg/kg,加生理鹽水至0.5 mL),對照組腹腔注射等量生理鹽水(0.5 mL)。

1.3.2 模型鑒定

造模12 h后,取幼鼠肺組織進行組織病理學檢測,觀察肺部是否有明顯病變。并根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、充血、肺不張改變的等級,按程度的“無、輕、中、重”分別計“0、1、2、3分”,然后累計總分,評分越高表示病理變化越嚴重[16]。

1.3.3 分組及給藥方式

模型組：幼鼠在造模前1 h灌胃給予10 mL/kg的1%羧甲基纖維素鈉,然后進行造模處理;黃芪甲苷組：幼鼠在造模前1 h灌胃給予黃芪甲苷溶液(10 mL/kg),然后進行造模處理[17];陽性對照組：幼鼠在造模前灌胃給予地塞米松(10 mL/kg),然后進行造模處理[18];對照組灌胃給予0.5 mL滅菌生理鹽水,造模12 h取幼鼠肺組織。

1.3.4 HE切片制作

幼鼠肺組織固定在10%中性福爾馬林中2 d;修塊：厚度約為 0.2～0.3 cm,大小為 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm;沖水：12 h;脫水：組織脫水機內(nèi)進行;浸蠟;包埋;切片;染色：將組織切片常規(guī)脫蠟至水,蘇木精液染色5 min,1%鹽酸乙醇2 s,流水沖洗15 min,0.5%伊紅液染色2 min,蒸餾水洗2 s,80%乙醇30 s,95%乙醇30 s,無水乙醇1 s,二甲苯(Ⅰ)2 s,二甲苯(Ⅱ)2 s,中性樹膠封固。通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖象系統(tǒng)采集分析樣本。

1.3.5 Western blot檢測

用研磨器將收集的肺組織研碎,收集細胞,加入適量預(yù)冷的1×PBS洗滌,加入裂解液充分裂解細胞,離心后取上清液進行蛋白質(zhì)濃度測定。然后用12%的分離膠,5%的濃縮膠進行蛋白質(zhì)電泳、90 V轉(zhuǎn)膜50 min、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、孵育TLR4、p38、p-p38抗體(1∶2000稀釋)和 GAPDH 抗體(1∶1000稀釋),37℃孵育2 h,洗滌3次,加羊抗兔二抗IgG(1∶20000稀釋)37℃孵育1 h,洗滌3次,然后將膜放置在暗室中,根據(jù)用量取ECL發(fā)光液A和B等量混勻,加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測。

1.3.6 qRT-PCR檢測

用研磨器將收集的肺組織研碎,收集細胞,用TRIzol法提取各組細胞總RNA,采用分光光度計測定RNA濃度和純度,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板,分別擴增看家基因和目的基因。PCR條件：94℃預(yù)變性4 min,94℃變性5 s,56℃退火10 s,72℃延伸25 s,共39個循環(huán),65℃7 min,95℃ 50 s。 用2-△△Ct法計算目的基因與看家基因的比值。引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料采用平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用Graphpad prism 5軟件制作統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定

造模12 h后,幼鼠肺呈現(xiàn)：間質(zhì)充血、出血(圖1左),肺水腫,肺泡間隔明顯增寬,大量肺泡萎陷,肺部正常組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失(圖1右)。

表1 Real-time PCR檢測引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

2.2 黃芪甲苷對SD幼鼠肺組織病理學的影響

幼鼠肺組織切片顯示,對照組肺泡形狀完好,未見充血、炎癥細胞浸潤、水腫等病理現(xiàn)象(圖2A、2a);模型組在建模后12 h呈現(xiàn)肺出血、肺泡腔內(nèi)有炎性細胞浸潤,大量肺泡萎陷(圖2B),24 h呈現(xiàn)肺水腫,肺泡間隔明顯增寬,充血(圖2b)。和模型組相比,黃芪甲苷組在12 h,僅呈現(xiàn)輕微的肺泡壁增厚,輕微充血(圖2C),24 h也僅表現(xiàn)輕微的肺泡壁增厚(圖2c)。地塞米松組病變程度較模型組顯著減輕(圖 2D、2d)。

模型組病理形態(tài)學積分與對照組有極顯著性差異(P＜0.001),表示建模成功,另外,黃芪甲苷組,地塞米松組與模型組有顯著性差異(P＜0.05),見表2。

2.3 黃芪甲苷對 SD幼鼠肺組織中 TLR4-p38 MAPKs信號通路蛋白表達的影響

從Western blot結(jié)果可以看出,模型組TLR4和p-p38蛋白相對表達量和對照組相比,明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)。黃芪甲苷組TLR4和p-p38蛋白相對表達量和模型組相比,均有明顯的降低(P＜0.05,P＜0.001),見圖 3。

2.4 黃芪甲苷對 SD幼鼠肺組織中 TLR4-p38 MAPKs信號通路核酸表達的影響

由q-PCR結(jié)果可以看出,模型組TLR4和P38相對表達量均高于對照組(P＜0.05)和地塞米松組(P＜0.05),模型組TLR4相對表達量和黃芪甲苷組相比,明顯升高(P＜0.05),見圖4。

2.5 黃芪甲苷對SD幼鼠肺組織中炎癥因子表達的影響

由qRT-PCR結(jié)果可以看出,和模型組相比,在注射黃芪甲苷后,TNF-α、IL-6、IL-12各炎癥因子均有下降的趨勢,其中模型組IL-12 mRNA相對表達量與地塞米松組和黃芪甲苷組有顯著性差異(P＜0.05),見圖 5。

圖1 急性肺損傷小鼠肺組織切片F(xiàn)igure 1 Lung section of mice with acute lung injury

表2 幼鼠肺組織病理形態(tài)學積分的變化(±s,n=6)Table 2 Pathomorphological changes of the lung tissues in rats

表2 幼鼠肺組織病理形態(tài)學積分的變化(±s,n=6)Table 2 Pathomorphological changes of the lung tissues in rats

注：與對照組比較,###P＜0.001;與模型組比較,*P＜0.05。Note.Compared with the control group,###P＜0.001.Compared with the model group,*P＜0.05.

組別Groups 病理學積分Pathology score對照組 Control group 1.71±1.18###模型組 Model group 14.5±2.42黃芪甲苷組 Astragaloside group 7.62±2.28*地塞米松組 Dexamethasone group 8.46±3.14*

圖2 小鼠肺組織病變Note.Figure A-D represents the lung sections of the 12 h control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.a-d represents the 24 h control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.Figure 2 lung tissue Lesions in mice

圖3 TLR4-p38 MAPKs信號通路蛋白表達Note.A,Relative expression of TLR4 protein.Compared with the control group#P＜0.05.Compared with the model group,*P＜0.05.B,Relative expression of p-p38 protein.Compared with the control group,##P＜0.01.Compared with the model group,***P＜0.001.Compared with the dexamethasone group,&&P＜0.01.C,TLR4-p38 MAPKs signaling pathway protein expression,1-4 show the control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.Figure 3 TLR4-p38 MAPKs signaling pathway protein expression

圖4 TLR4-p38 MAPKs信號通路核酸表達Note.A,Relative expression of TLR4 mRNA,the 4 bars in the figure show the control group,model group,astragaloside group,dexamethasone group.Compared with the control group,#P ＜0.05.Compared with the model group,*P ＜0.05.Compared with the dexamethasone group,&P＜0.01.B,Relative expression of p38 mRNA.Figure 4 TLR4-p38 MAPKs signaling pathway nucleic acid expression

圖5 炎癥因子表達Note.A,Relative expression of TNF-α mRNA.B,Relative expression of IL-12 mRNA.Compared with the model group,*P ＜0.05.Compared with the dexamethasone group,&P＜0.01.C,Relative expression of IL-6 mRNA.Figure 5 Expression of inflammatory factors

3 討論

ALT是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷,造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全。大多數(shù)患者在臨床上有急性呼吸窘迫綜合征急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALT病死率高,有研究表明該病病死率高達44.3%[19]。ALT在病理學上表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、肺泡毛細血管通透性增加,隨著病情進展導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎和肺纖維化[20]。造成ALT的原因有很多,比如感染、膠原血管疾病、藥物不良反應(yīng)、休克、急性嗜酸性粒細胞肺炎、免疫介導(dǎo)的肺出血和血管炎、放射性肺炎等[21]。其中革蘭陰性桿菌感染是引起ALI的常見因素。細胞壁的LPS是革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素的主要成分,也是最主要的致病因素[22]。本研究用LPS誘導(dǎo),建立SD幼鼠急性肺損傷模型,ALI的病理基礎(chǔ)與肺內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)所致的肺毛細血管膜損傷,肺水腫及透明膜形成有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示,黃芪甲苷組小鼠肺病變,和模型組相比,充血、出血、水腫、炎性細胞浸潤的情況明顯減輕,這說明黃芪甲苷能有效緩解LPS造成的SD小鼠的肺部損傷。

MAPKs是細胞內(nèi)廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可參與多種細胞反應(yīng)的調(diào)節(jié),如細胞增殖分化、凋亡、癌基因轉(zhuǎn)化等[24-25]。p38MAPK信號通路參與類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等多種炎癥疾病的發(fā)生過程,是一種重要的炎癥調(diào)控因子[26-27]。黃芪多糖抗炎作用機制與抑制p38MAPK信號通路有關(guān),目前在哮喘氣道炎癥、心臟炎癥等炎癥發(fā)生中已經(jīng)證實[28-29],且有報道稱TLR4可激活MAPKs信號通路[6],本研究中,發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能有效降低TLR4和p-p38的表達量。炎癥因子在炎癥反應(yīng)中起決定性作用,在急性腎損傷早期,IL-1β能夠通過提高白細胞CD11/CD18的表達水平、促進內(nèi)皮細胞ICm-1表達等方式召集炎癥細胞進入腎間質(zhì)[30]。TNF-α也是一種促炎因子,其在急性組織損傷中表達上調(diào),TNF-α能夠促進炎癥發(fā)生[31]。在慢性肺炎中IL-6也對病情的發(fā)展起重要作用[32]、IL-12也是重要的炎癥因子[33]。有報道稱,黃芪甲苷可能通過MAPK/ERK通路促進LPS誘導(dǎo)的BMSCs增殖,抑制其凋亡和促炎細胞因子的分泌[34]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷組炎癥因子的表達量有所降低,其中IL-12和模型組有顯著性差異,這表明黃芪甲苷能有效抑制炎癥因子的表達,進而抑制機體產(chǎn)生過強的炎癥反應(yīng),來保護由LPS造成的SD小鼠的肺損傷。

綜上所述,黃芪甲苷能減輕SD小鼠肺病變程度,抑制TLR4和p-p38的表達水平,降低炎癥因子TNF-α,IL-6,IL-12的表達量,表明黃芪甲苷可能通過抑制TLR4-p38MAPK信號通路發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)和緩解肺損傷的作用。