文雪霞，文 潤，張 瑩

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院/東北畜禽疫病研究教育部重點實驗室，沈陽 110161）

真核生物細(xì)胞周期主要由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependentkinase，CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（cyclin dependentkinase inhibitor，CDKI）調(diào)控[1]。CDKI通過抑制CDK的活性負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期進程。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異，CDKI可分為INN4和CIP/Kip兩個家族[2]。其中，CIP/Kip家族蛋白可結(jié)合所有的cyclin-CDK復(fù)合物并抑制CDK活性，p21蛋白即屬于CIP/Kip家族[3]。p21蛋白具有多種功能，它不僅可作為CDKI負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期進程，還可參與調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)[4]、細(xì)胞凋亡[5]和細(xì)胞自噬[6]等。此外，越來越多的研究表明，p21蛋白在病毒感染過程中也發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究將對p21蛋白的功能（圖1）及在病毒感染中的作用進行介紹，以期為研究病毒感染和p21蛋白之間的相互作用提供參考。

1 p21蛋白功能

1.1 p21蛋白與細(xì)胞周期

真核生物細(xì)胞周期分為分裂間期（G1、S和G2期）和分裂期（M）期[1]。在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，p21蛋白與cyclin A-CDK2/cyclin E-CDK2復(fù)合物結(jié)合抑制CDK2活性，使細(xì)胞停滯于G1期[9]。當(dāng)細(xì)胞接受到有絲分裂信號后，cyclin D-CDK4/cyclin D-CDK6復(fù)合物活化并磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb），使后者從與轉(zhuǎn)錄因子E2F的復(fù)合物解離。解離后的轉(zhuǎn)錄因子E2F轉(zhuǎn)錄包括cyclin E1和cyclin E2在內(nèi)的參與由G1期進入S期的蛋白。新合成的cyclin E1和cyclin E2與CDK2結(jié)合形成cyclin E1/E2-CDK2復(fù)合物，該復(fù)合物又可進一步磷酸化pRb，通過正反饋調(diào)節(jié)方式不斷擴大細(xì)胞反應(yīng)。隨著cyclin E1和cyclin E2蛋白水平的不斷升高，cyclin D-CDK4和cyclin D-CDK6復(fù)合物結(jié)合p21蛋白，從而使被抑制的CDK2活性恢復(fù)，細(xì)胞進入S期[10]。

p21蛋白也參與調(diào)控細(xì)胞由G2期進入M期。CDK1是在細(xì)胞G2期和M期發(fā)揮作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，cyclin B-CDK1和cyclin A2-CDK1復(fù)合物能夠促進細(xì)胞進入M期[1]。p21蛋白可使細(xì)胞周期停滯于G2期，調(diào)控機制有4種：（1）p21蛋白可下調(diào)早期有絲分裂抑制蛋白1（Emi1），進而激活后期促進復(fù)合物/環(huán)體（APC/C），APC/C 則可降解 cyclin B 和 cyclin A2[11]。（2）p21蛋白可通過 CDK 激活酶（CAK）抑制 CDK1第 161位蘇氨酸磷酸化進而抑制CDK1活性[12]。（3）p21蛋白可將cyclin B-CDK1滯留于細(xì)胞核內(nèi)，以防該復(fù)合物被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酶激活[13]。（4）p21蛋白可與cyclin A2-CDK1復(fù)合物結(jié)合抑制細(xì)胞進入M期[14]。

除通過cyclin-CDK調(diào)控細(xì)胞周期進程外，p21還可通過結(jié)合DNA聚合酶δ活性因子——增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抑制DNA合成誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[15]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該功能與p21第145，146或160位絲氨酸磷酸化有關(guān)[16]。

1.2 p21蛋白與炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是機體基本的自我保護機制之一。p21蛋白通過抑制巨噬細(xì)胞過度活化和促進中性粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)[4，17-18]。p21蛋白以負(fù)反饋方式抑制巨噬細(xì)胞過度活化。研究發(fā)現(xiàn)，敲除p21蛋白的巨噬細(xì)胞在脂多糖（LPS）刺激后，IκBα激酶活性升高、IκBα磷酸化和降解增加、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性升高、促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β表達(dá)上調(diào)[17，19]。同時，p21蛋白敲除小鼠對LPS誘導(dǎo)的感染性休克更敏感，表明p21蛋白有助于維持炎癥反應(yīng)的平衡且提示p21蛋白在巨噬細(xì)胞活化中的作用具有重要的生物學(xué)意義[17]。巨噬細(xì)胞可極化為M1型促炎狀態(tài)和M2型抗炎狀態(tài)，代表巨噬細(xì)胞群體中免疫調(diào)節(jié)的兩個極端。因此，處于兩個極端中間狀態(tài)的細(xì)胞對維持炎癥反應(yīng)的平衡至關(guān)重要，而p21蛋白水平的變化可調(diào)控該過程[4]。具體來說，p21蛋白通過調(diào)控p65-p50和p50-p50二聚體與基因組中NF-κB結(jié)合位點的親和力，調(diào)控M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)變，從而維持炎癥反應(yīng)的平衡[4]。此外，p21蛋白還可限制T細(xì)胞的過度活化[20]。中性粒細(xì)胞凋亡有利于炎癥的消退。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的嗜中性粒細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中存在高水平的PCNA與pro-caspases結(jié)合，阻止后者的活化，從而抑制中性粒細(xì)胞的凋亡。p21蛋白的衍生肽可與pro-caspases競爭結(jié)合PCNA，誘發(fā)中性粒細(xì)胞凋亡，有利于炎癥的消退[18]。

1.3 p21蛋白與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因控制的細(xì)胞的程序性死亡。細(xì)胞凋亡也是機體清除被病原體感染的細(xì)胞、釋放病毒的一種機制[21]。p21蛋白在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮雙重作用[6，22]。一方面，p21蛋白可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。該功能最早于1996年由WALDMAN等[23]提出。研究表明，不依賴p53調(diào)控表達(dá)的p21蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，其機制主要有兩種：（1）p21蛋白可與促凋亡因子如caspase-3、caspase-8、caspase-10和細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）相互作用，也可抑制caspase-3上游的caspase-2發(fā)揮作用[24]。p21蛋白與caspases相互作用使其在核定位信號序列區(qū)被切割，進而阻礙p21蛋白入核，抑制DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞質(zhì)中，p21蛋白與ASK1相互作用可阻礙應(yīng)激激活的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，從而抑制細(xì)胞凋亡。（2）p21蛋白可通過抑制caspase依賴的CDK的激活阻礙染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞皺縮從而抑制細(xì)胞凋亡[5]。另一方面，p21蛋白可促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生，依賴或不依賴p53調(diào)控表達(dá)的p21蛋白均可發(fā)揮此功能。p21蛋白通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax或激活TNF家族死亡受體（TRAIL）促進細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。p21蛋白在細(xì)胞凋亡過程中的雙重作用取決于p21蛋白細(xì)胞定位和凋亡誘導(dǎo)物的不同。當(dāng)p21蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中時，它阻斷pro-caspase 3和應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。而當(dāng)p21蛋白位于細(xì)胞核中時，則促進了DNA損傷后的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。不同水平的DNA損傷可能也會決定p21蛋白對細(xì)胞凋亡的反應(yīng)，高水平的DNA損傷可下調(diào)p21蛋白水平，促進細(xì)胞凋亡，而低水平的DNA損傷可穩(wěn)定p21蛋白水平，從而使細(xì)胞周期停滯[26]。

1.4 p21蛋白與細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，該過程由細(xì)胞自噬相關(guān)基因調(diào)控。自噬可防止各種內(nèi)源性或傳染源引起的機體內(nèi)膜損傷，并防止不必要或過度的炎癥發(fā)生，因此，自噬實際上是機體的一種抗炎機制[27]。p21蛋白可令自噬因子處于非活性狀態(tài)[28]。p21蛋白在自噬誘導(dǎo)中的調(diào)節(jié)作用非常復(fù)雜，依賴于細(xì)胞種類及其所處的生長環(huán)境。過表達(dá)p21蛋白增加細(xì)胞對自噬誘導(dǎo)的敏感性，促進一些成纖維細(xì)胞株的腫瘤生長，然而在乳腺癌細(xì)胞中p21蛋白的過表達(dá)則表現(xiàn)出相反的作用[29]。此外，p21蛋白過表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺類似物處理的成纖維細(xì)胞的自噬，它也與白藜蘆醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞自噬相關(guān)[30]。

在某些情況下，p21蛋白對細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控協(xié)同進行[31-34]。研究發(fā)現(xiàn)，p21蛋白與異戊烯半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（ICMT）抑制劑誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬和凋亡密切相關(guān)[31-34]。ICMT抑制劑處理細(xì)胞可上調(diào)p21蛋白水平，而p21蛋白又可上調(diào)表達(dá)BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）、微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B（LC3）和Unc-51樣自噬激活激酶1（ULK1）。其中，ULK1和LC3可促進自噬小體的起始和延伸；BNIP3屬于BCL2家族（可促進細(xì)胞凋亡），其蛋白基序類似于可同時調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡BH3結(jié)構(gòu)域[35-39]。BNIP3上調(diào)可使癌細(xì)胞更易發(fā)生細(xì)胞凋亡，相反地，BNIP3下調(diào)使癌細(xì)胞更能抵抗治療[40-42]。因此，大多癌細(xì)胞的BNIP3蛋白表達(dá)是受抑制的[43-46]。在對ICMT抑制劑敏感的MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞中，p21蛋白表達(dá)水平的降低可防止細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡。

圖1 p21蛋白的功能Figure 1 The function of p21 protein

2 p21蛋白在病毒感染中的作用

2.1 p21蛋白在人免疫缺陷病病毒（HIV）感染中的作用

HIV為逆轉(zhuǎn)錄病毒，它感染人類免疫細(xì)胞，侵害機體免疫系統(tǒng)[7]。一旦感染細(xì)胞，HIV即整合到宿主細(xì)胞基因組。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶的磷酸化，該過程由宿主細(xì)胞CDK2高度保守的蘇氨酸介導(dǎo)。CDK2對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的磷酸化不僅可提高逆轉(zhuǎn)錄酶的功效和穩(wěn)定性，還可增強病毒的適應(yīng)性。全球感染HIV病毒的人中，不到1%的人擁有足夠強的免疫系統(tǒng)來長時間抑制這種病毒，這些人被稱為“精英控制者”。研究發(fā)現(xiàn)，在“精英控制者”體內(nèi)的CD4（+）T細(xì)胞中，HIV可通過下調(diào)miR-106b和miR-20a上調(diào)p21蛋白表達(dá)[8，47]。由于p21蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)在的CDKI，它的上調(diào)可有效抑制CDK2對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的磷酸化，顯著降低病毒逆轉(zhuǎn)錄的效率[48]。這也是“精英控制者”體內(nèi)的CD4（+）T細(xì)胞對HIV更不易感的原因。敲低“精英控制者”體內(nèi)的CD4（+）T細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)，HIV逆轉(zhuǎn)錄和mRNA合成均上調(diào)，同時上調(diào)的還有調(diào)控HIV基因表達(dá)的共轉(zhuǎn)錄因子 CDK9 的酶活性[7，49]。

在由單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中，p21蛋白可通過兩種機制抑制HIV復(fù)制。一方面，p21蛋白可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F1的活性抑制核糖核苷酸還原酶RNR2亞基的轉(zhuǎn)錄，從而下調(diào)RNR2亞基的表達(dá)。RNR2亞基對于將核糖核苷酸還原為脫氧核苷酸至關(guān)重要，因此，p21通過下調(diào)該蛋白來阻止dNTP的生物合成[50-52]。另一方面，p21蛋白抑制cyclin A/CDK1/2復(fù)合物磷酸化SAMHD1蛋白的第592位蘇氨酸，以此抑制SAMHD1蛋白的抗病毒活性[53-56]。這表明p21蛋白同時調(diào)節(jié)dNTP的合成和SAMHD1的抗病毒功能來抑制HIV[51，53，57，58]。

2.2 p21蛋白在Epstein-Barr病毒（EBV）感染中的作用

EBV是一種常見的皰疹病毒，與人類的許多惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)[59]。EBV感染可引起胃癌，免疫組化結(jié)果顯示這與p21蛋白的低表達(dá)有關(guān)[60]。進一步研究表明，EBV編碼的BARF1基因可通過激活NF-κB信號通路和降低p21蛋白的表達(dá)促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[61]。一方面，BARF1蛋白可使細(xì)胞中IκBα發(fā)生磷酸化、泛素化修飾，進而被降解。IκBα的降解使NF-κB進入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄cyclin D1[62]，同時抑制p21蛋白的表達(dá)。另一方面，BARF1蛋白本身也可下調(diào)p21蛋白的表達(dá)。

2.3 p21蛋白在冠狀病毒感染中的作用

冠狀病毒宿主范圍廣泛，可感染包括人類在內(nèi)的多種生物[63]。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是感染豬的一種冠狀病毒，研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染可通過其編碼的N蛋白使細(xì)胞停滯于S期和G2/M期，為病毒復(fù)制創(chuàng)造有利條件[64]。該過程由p21和p53蛋白水平的升高和cyclin B1、cdc2和CDK2蛋白水平的降低調(diào)控[64]。鼠肝炎病毒（MHV）是可感染小鼠的一種冠狀病毒，該病毒感染可通過降低CDK4和CDK6活性，同時下調(diào)CDK4、cyclin D和cyclin E蛋白水平，使感染細(xì)胞停滯于G0/G1期[65]。MHV編碼的p28蛋白也可引起細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，但其調(diào)控方式與病毒感染稍有差異。p28蛋白可通過p53蛋白上調(diào)p21蛋白mRNA水平，而p21蛋白的表達(dá)則可抑制cyclin E-CDK2復(fù)合物的活性，從而抑制細(xì)胞進入S期[66]。

2.4 p21蛋白在其他病毒感染中的作用

人乳頭瘤病毒（HPV）編碼的E7蛋白與p21蛋白C-末端相互作用，不僅使p21蛋白與cyclin-CDK2復(fù)合物解離，CDK2活性恢復(fù)，而且恢復(fù)PCNA依賴的DNA復(fù)制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進入S期[67-68]。A型流感病毒（IAV）是一種重要的人畜共患病病原，可感染多種禽類、犬貓、豬和人類等[69]。研究表明，IAV感染可下調(diào)cyclin E和cyclin D1蛋白水平，同時上調(diào)p21蛋白水平，從而阻止細(xì)胞進入S期。宿主細(xì)胞周期停滯于G0/G1期為IAV復(fù)制創(chuàng)造了有利條件[70]。

3 展望

p21蛋白經(jīng)典的功能是作為CDKI調(diào)控細(xì)胞周期進程，關(guān)于p21蛋白在病毒感染中作用的研究也大多集中對此功能的調(diào)控上。病毒感染后可靶向p21蛋白調(diào)控細(xì)胞周期，從而為自身復(fù)制創(chuàng)造有利條件。目前關(guān)于細(xì)胞周期調(diào)控對病毒的影響方面已取得了一些研究進展，但是，對病毒感染或病毒蛋白調(diào)控p21蛋白的機制還不十分清楚，仍需深入系統(tǒng)研究。除了經(jīng)典的功能外，p21蛋白還可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，對這些功能的研究多集中在癌癥和自身免疫病上。許多病毒感染可調(diào)控細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、凋亡和自噬，這些研究表明，p21蛋白可能在其中發(fā)揮了一定作用。以p21蛋白為切入點研究病毒感染與宿主的相互作用，不僅有助于全面深入了解p21的蛋白功能，而且有助于解析病毒的致病機制。