高楊

摘?要：2020年丹東東港市某養(yǎng)殖廠養(yǎng)殖1齡牙鲆（Paralichthys olivaceus）突發(fā)病害，表現(xiàn)為腹水病癥狀。取患病的5尾養(yǎng)殖牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水為材料進(jìn)行細(xì)菌分離及純培養(yǎng)，選擇優(yōu)勢(shì)菌株通過(guò)全自動(dòng)細(xì)菌分析儀及16S rDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離純培養(yǎng)的14株菌（DS200401-DS200414）共鑒定出2種，其中1種為該病的致病菌：弧菌屬燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。隨后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。用12種抗菌藥物對(duì)3種菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)， 結(jié)果顯示在不同菌株間無(wú)明顯的敏感與耐藥性差異。

關(guān)鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）;燦爛弧菌（Vibrio splendidus）;藥敏試驗(yàn)

丹東東港市8 667 hm2（13萬(wàn)畝）海水池塘普遍采用多品種立體生態(tài)養(yǎng)殖模式[1]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）作為混養(yǎng)的重要海水低溫經(jīng)濟(jì)品種[2]，屬于蝶形目（Pleuronectiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆屬（Paralichthys），由于肉質(zhì)鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。在牙鲆養(yǎng)殖過(guò)程中，由于操作管理不當(dāng)和投喂冷凍野雜魚(yú)的養(yǎng)殖方式，增加了細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，常常導(dǎo)致細(xì)菌病爆發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。2020年丹東東港市某養(yǎng)殖場(chǎng)大面積暴發(fā)牙鲆腹水病，主要病原是燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。筆者對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，對(duì)分離出的致病菌進(jìn)行了16S rDNA序列分析、藥敏試驗(yàn)，為養(yǎng)殖牙鲆的病害研究提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

2020年4月東港市某牙鲆養(yǎng)殖戶反映，患病牙鲆表現(xiàn)為體色發(fā)黑，眼球突出，腹水嚴(yán)重，直至全部感染。送檢的5尾瀕死牙鲆，體長(zhǎng)約25.31～29.86 cm。健康牙鲆取自東港市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?肉眼檢查及剖檢?肉眼觀察患病牙鲆的體表癥狀，解剖病魚(yú)，對(duì)鰓組織進(jìn)行鏡檢，并記錄。

1.2.2?細(xì)菌分離?在無(wú)菌條件下，取患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，用接種環(huán)接種于2216E瓊脂海水培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上[3-4]，劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌的單菌落，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上純化培養(yǎng)。

1.2.3?細(xì)菌鑒定

1.2.3.1?分子生物學(xué)鑒定?對(duì)分離菌株進(jìn)行常規(guī)16S rDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3.2?生化鑒定?采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行生化特征分析。

1.2.4?人工感染試驗(yàn)?試驗(yàn)牙鲆為東港地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)健康牙鲆10尾，體長(zhǎng)8～10 cm，暫養(yǎng)于兩個(gè)200 L水族箱中，溫度控制在15 ℃，充氧并少量投食。試驗(yàn)組與對(duì)照組各10 L水體分別放入5尾牙鲆，采用注射感染[5]方法，每尾魚(yú)注射0.05 mL約108 cfu/mL的菌懸液，對(duì)照組注射 0.05 mL無(wú)菌生理鹽水。觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.5?藥敏試驗(yàn)?對(duì)所分離并經(jīng)鑒定的菌株，采用[6]瓊脂擴(kuò)散紙片法（K-B）進(jìn)行對(duì)常用抗菌類藥物的敏感性測(cè)定。

2?結(jié)果與分析

2.1?發(fā)病情況及主要病變

2020年4月東港市某牙鲆養(yǎng)殖場(chǎng)反映，3月20日左右，十余家養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的1齡牙鲆，經(jīng)室內(nèi)越冬池轉(zhuǎn)移到室外土池塘?xí)r，均出現(xiàn)魚(yú)體發(fā)黑，眼球突出，腹部膨大，停止攝食最終死亡。共計(jì)養(yǎng)殖牙鲆100萬(wàn)尾，病死率高達(dá)67.6%。送檢的5尾患病牙鲆，體長(zhǎng)約25.31～29.86 cm，鰓絲完好，1尾體表有潰爛，解剖后5尾魚(yú)存在白色混濁腹水，肝臟脾臟腫大，腸壁出現(xiàn)充血水腫，腸道內(nèi)無(wú)食物且充滿淡黃色黏液，1尾腸道內(nèi)有白色線團(tuán)狀物。

2.2?病原形態(tài)特征

取病魚(yú)的鰓、肝、脾、腸道、腹水進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，從鰓上分離出一株細(xì)菌，只在2216E平板上生長(zhǎng)，形成圓形光滑，邊緣整齊突出，白色較小的菌落。在脾臟、腸道、腹水中分離出的細(xì)菌，同時(shí)生長(zhǎng)于2216E平板和TCBS平板，形成圓形光滑，黃色突起的菌落，大小有差異。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌。

2.3?病原菌的生理、生化鑒定

由全自動(dòng)細(xì)菌分析儀對(duì)病原菌的生理生化檢測(cè)結(jié)果可知，該病原菌初步鑒定為弧菌屬細(xì)菌。

將分離菌所擴(kuò)增的16S rDNA基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)結(jié)果顯示，從鰓上分離出的菌株 DS200401為腸桿菌。從脾臟，腸道，腹水中分離出的菌株DS200404、DS2004008、DS2004013基因與燦爛弧菌（Vibrio splendidus）相應(yīng)基因相似率達(dá)98%。分離菌所擴(kuò)增的16S rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號(hào)為MT445177-MT445179，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1，菌株與燦爛弧菌聚為一支。

2.4?人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)組的5尾牙鲆魚(yú)感染后的4～5 d死亡2尾，發(fā)病3尾，解剖觀察肝臟脾臟出現(xiàn)腫大，腸道有黃色黏液，3尾魚(yú)有腹水。對(duì)發(fā)病牙鲆進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果與原感染菌一致 。

2.5?藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，三株細(xì)菌DS200404、DS2004008、DS2004013對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等抗生素敏感，對(duì)青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。不同菌株間耐藥差異不明顯。

3?討論

作者首次從丹東地區(qū)患病的牙鲆體內(nèi)分離出三株菌，并命名為DS200404、DS2004008、DS2004013。經(jīng)鑒定均為燦爛弧菌。該菌是刺參腐皮病[7-9]的主要病原，感染牙鲆的文章還未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)人工感染試驗(yàn)可知，該菌是致病菌，也是牙鲆細(xì)菌病的主要病原之一。

牙鲆弧菌病發(fā)于春夏季節(jié)[4，5，10]，尤其早春季節(jié)危害最為嚴(yán)重 。養(yǎng)殖牙鲆經(jīng)歷越冬期后，免疫力較低，放入土池后，由于環(huán)境改變，易發(fā)生細(xì)菌感染;池塘清池時(shí)若殘留漂白粉等藥物，易造成牙鲆藥物中毒;傳統(tǒng)的投喂冷凍野雜魚(yú)的養(yǎng)殖方式[11]，增大了牙鲆細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，燦爛弧菌對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等6種抗生素敏感。在防治水產(chǎn)生物細(xì)菌性疾病時(shí)不要濫用[12]抗生素類藥物，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，增加病害控制的難度。確定藥物的最低有效濃度及菌株的耐藥性是下一步工作的方向。

通過(guò)以上檢測(cè)結(jié)果可知，此次牙鲆魚(yú)養(yǎng)殖池暴發(fā)的腹水病主要病原是燦爛弧菌，建議養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過(guò)程中保證良好水質(zhì)，選擇優(yōu)質(zhì)餌料，提高魚(yú)體抗病力，并用配合飼料替代冷凍野雜魚(yú)降低感染風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]

王會(huì)芳，李小進(jìn)，于守鵬.遼寧丹東多品種立體生態(tài)養(yǎng)殖模式介紹[J].中國(guó)水產(chǎn)，2017（12）：52-56.

[2] 薛淑霞，馮守明，孫金生.海水工廠化養(yǎng)殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）和褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）腹水病病原菌的分離與鑒定[J].海洋與湖沼，2006（06）：548-554.

[3] 肖穎，李曉玥，張亞寧，等.牙鲆遲鈍愛(ài)德華氏菌的分離及其鑒定[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，34（04）：481-486.

[4] 陳翠珍，房海，張曉君，等.牙鲆魚(yú)腸道弧菌感染癥及病原特性研究[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2006（05）：80-86.

[5] 常建波，宮向紅，孫逢賢，等.養(yǎng)殖牙鲆弧菌病病原菌初步研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2001（01）：37-41.

[6] 張曉君，戰(zhàn)文斌，陳翠珍，等.牙鲆遲鈍愛(ài)德華氏菌感染癥及其病原的研究[J].水生生物學(xué)報(bào)，2005（01）：31-37.

[7] 呂新芳，孔令明，王學(xué)廣，等.仿刺參硫氧還蛋白基因在燦爛弧菌和鰻弧菌刺激下的應(yīng)激表達(dá)特征[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2015，50（11）：16-22.

[8] 葛輝，何麗斌，林琪，等.福建海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合癥”病原分析與鑒定[J].福建水產(chǎn)，2012，34（02）：105-110.

[9] 王印庚，榮小軍，張鳳萍，等.養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合征”致病菌——燦爛弧菌的原位雜交檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2013，34（02）：114-118.

[10] 王志敏，張文香，馮力霞，等.牙鲆仔魚(yú)腸道白濁病病原菌的分離鑒定[J].河北漁業(yè)，2005（01）：11-15.

[11] 劉朝陽(yáng).養(yǎng)殖大菱鲆常用餌料攜帶的細(xì)菌與其疾病發(fā)生的相關(guān)性分析[D].中國(guó)海洋大學(xué)，2007.

[12] 李正義，賈俊濤，陳曉，等.養(yǎng)殖大菱鲆出血病病原菌的分子生物學(xué)鑒定[J].水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（1）： 44-47.

（收稿日期：2020-06-02）