陳蕾, 陳淑頤, 周剛, 黃宇宏, 李偉, 王靜安, 肖調義, 劉巧林

赤眼鱒-肌動蛋白基因克隆、組織表達與穩(wěn)定性分析

陳蕾, 陳淑頤, 周剛, 黃宇宏, 李偉, 王靜安, 肖調義, 劉巧林

(湖南農(nóng)業(yè)大學 湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術研究中心, 湖南 長沙, 410128)

為探究赤眼鱒()-肌動蛋白(actin)基因的結構和表達特性, 本文采用RT-PCR技術和RACE法, 從赤眼鱒肝臟中獲得了赤眼鱒actin cDNA全長序列(GenBank: MT119965), 該基因cDNA全長共1 816 bp, 由94 bp的5’端非編碼區(qū), 594 bp的3’端非編碼區(qū)和1 128 bp的開放閱讀框(95-1222)組成, 閱讀框共編碼375個氨基酸。通過序列比對和系統(tǒng)進化樹的構建, 赤眼鱒actin與鯉科魚類聚為一支且與鯪魚、鯽魚、黃顙魚等多個物種的actin氨基酸同源性都為99%。熒光定量(qPCR)表達分析顯示,actin在赤眼鱒肌肉、腸、脾臟、皮膚、血液、鰓、體腎、頭腎、心臟和肝臟十個組織中都有表達, 但不同組織的表達量存在差異。利用Best keeper軟件對赤眼鱒體內的延伸因子1(elongation factor 1,)和actin基因進行穩(wěn)定性對比, 發(fā)現(xiàn)actin基因穩(wěn)定性低于EF1基因。以上結果為赤眼鱒的分子系統(tǒng)進化研究提供證據(jù), 也為赤眼鱒功能基因表達研究提供參考依據(jù)。

赤眼鱒;-肌動蛋白; 基因克隆; 組織表達; 穩(wěn)定性

肌動蛋白在真核細胞內廣泛存在, 是細胞骨架和肌小節(jié)的主要組成成分, 幾乎參與了細胞所有的生命活動[1], 在細胞結構、細胞運動、細胞分裂等生命活動中都發(fā)揮了重要作用[2–3]。根據(jù)等電點的不同, 肌動蛋白可分為、、3類[4]。目前針對水產(chǎn)動物-肌動蛋白(actin)基因的研究較多, 如三角帆蚌()[5]、牡蠣()[6]和草魚()[7]等。多種物種actin基因研究表明,actin氨基酸編碼區(qū)具有高度保守性。大鱗副泥鰍()actin氨基酸序列與脊椎動物的相似性在98%以上, 與其他動物的相似性不低于97%[8]松江鱸()actin基因序列與其他物種的同源性在79.58%～97.16%[9]。同時, 因actin基因具有表達數(shù)量高且穩(wěn)定的特點[10–11], 所以在熒光定量PCR技術中常采用actin基因作為參照, 如草魚[12]、皺紋盤鮑()[13]和達氏鱘()[14]等。但隨著對actin基因的深入研究, 發(fā)現(xiàn)存在表達量不穩(wěn)定的情況, 如Sarmiento等[15]發(fā)現(xiàn)廣溫性的鯉()的actin基因在夏季和冬季的表達量發(fā)生了變化。因此近些年來為了篩選出最穩(wěn)定的內參基因, 有大量研究關于幾個常用內參基因在不同生物體內的穩(wěn)定性, 如GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、EF1(延伸因子1)以及actin等。大部分研究表明, 無論是在植物體內[16], 還是動物體內[17]actin都是較為可靠的內參基因。

赤眼鱒屬硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、赤眼鱒屬, 俗稱野草魚、紅眼魚[18], 具有生長快、適應性強、經(jīng)濟價值高等優(yōu)點。目前已針對赤眼鱒開展了生物學特性[19]、資源現(xiàn)狀[20]、免疫特性[21]、基因挖掘[22]等功能多方面的研究, 但沒有赤眼鱒actin基因cDNA克隆和表達分析, 更無內參基因篩選的相關報道。

本研究通過RT-PCR和RACE技術, 從赤眼鱒肝臟中克隆出actin基因cDNA全長序列, 對其進行氨基酸理化性質和同源性分析, 并采用actin基因為外源基因, 構建系統(tǒng)進化樹, 探究赤眼鱒與其他物種的進化關系。通過qPCR技術分析赤眼鱒actin基因在10個組織的表達, 并與生物體內常用內參EF1基因做穩(wěn)定性對比。為利用actin基因作為內參基因分析赤眼鱒的基因表達研究提供序列依據(jù), 也為赤眼鱒的分子系統(tǒng)進化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

湖南瀏陽市烏龍漁場采5尾5月齡健康赤眼鱒, 丁香酚(國藥, 上海)麻醉后解剖采集赤眼鱒肝臟、肌肉、腸、脾臟、皮膚、血液、鰓、體腎、頭腎和心臟, 剪成100 mg左右大小分裝樣品管中, 液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 赤眼鱒組織總RNA抽提和cDNA合成

按照TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction (TaKaRa, China)試劑盒說明書分別提取肝臟、肌肉、腸、脾臟、皮膚、血液、鰓、體腎、頭腎和心臟總RNA。按Clontech公司SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的操作步驟將肝臟總RNA合成 5’-RACE- Ready cDNA和3’-RACE- Ready cDNA, 備用。取上述10個組織總RNA分別按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas, 美國)試劑盒說明書合成熒光定量分析用cDNA模板, 備用。

1.2.2 赤眼鱒基因克隆

根據(jù)NCBI中公布的草魚(, GenBank: AAA49197.1)和鯽魚(, GenBank: AB039726.2)的核苷酸序列設計保守區(qū)域PCR擴增引物(表1), 并送往上海生工生物工程公司合成。擴增β肌動蛋白基因cDNA核心片段, 反應體系(總體積50 μL): 赤眼鱒肝臟cDNA 2 μL、0.5 μL TaKaRa ExTaq 酶(TaKaRa, 大連)、5 μL 10×Ex Taq緩沖液、2 μL dNTP(10 mmol/L each)、正反引物(10 μmol)各1 μL和38.5 μL 滅菌超純水。擴增產(chǎn)物直接送上海生工測序。根據(jù)克隆得到的赤眼鱒actin的cDNA 核心片段, 設計5’和3’的特異性引物(表1, 上海生工合成), 按照TaKaRa RACE試劑盒說明書進行擴增, 獲得基因cDNA 5’端序列和3’端序列。

表1 本實驗中用的引物序列

1.2.3 序列分析

運用ExPASy Proteomics Server-ProtParam軟件分析赤眼鱒-肌動蛋白基因氨基酸理化性質。利用SOSUI工具和SignalP 3.0分別對-肌動蛋白氨基酸序列進行了信號肽預測。通過軟件TMHMM-2.0對-肌動蛋白進行跨膜結構預測。通過MEGA-X軟件的鄰接法, 設置重復值為1000構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 赤眼鱒actin基因的組織表達

以EF1為內參基因, 對赤眼鱒actin基因進行組織表達分析。根據(jù)NCBI中魚類EF1基因序列和擴增赤眼鱒actin基因序列設計熒光定量引物(表1), 送往上海生工公司合成。用SYBR Green I 染液(TAKARA,China)在CFX96 熒光定PCR儀(Bio–Rad, USA)測得赤眼鱒actin基因在肌肉、腸、皮膚、脾臟、體腎、血液、頭腎、心臟、鰓和肝臟的表達量, 共進行5次生物重復, 每個生物重復進行3次技術重復, qPCR 反應體系參照金生振等的文獻報道[23]。應用Bio-Rad CFX Manager軟件,采用2–ΔΔCt法計算相對表達量, 并用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA), 顯著性水平為<0.05。

1.2.5 內參基因穩(wěn)定性分析

利用Excel計算出1.2.4步驟所獲得的3次技術重復所得值的幾何平均數(shù), 即為CP值, 將CP值輸入Best Keeper軟件的“CP date input”區(qū)域。當CP值輸入完畢后, Best Keeper程序將會自動計算好的相關系數(shù)()、標準偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)等數(shù)據(jù), 最后根據(jù)所得結果推斷基因表達穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 赤眼鱒β-actin基因序列分析

赤眼鱒actin基因cDNA全長共1 816 bp(GenBank: MT119965), 開放閱讀框(95-1222)1 128 bp, 編碼375個氨基酸, 5’端非編碼區(qū)為94 bp, 3’端非編碼區(qū)為594 bp, 推算的分子量約為41.75 kDa, 理論等電點5.30。3’端非編碼區(qū)還含有1個“AATAAA”的mRNA加尾信號(圖1)。

注: 小寫字母: 非翻譯區(qū); 大寫字母: 編碼區(qū); 下劃線: 多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA); *: 終止密碼子。

2.2 β-actin氨基酸序列同源性分析和進化樹的構建

將赤眼鱒與多個物種的actin氨基酸序列通過NCBI中Protein Blast比對發(fā)現(xiàn), 赤眼鱒與黃顙魚(, AJE63408.1)、鯽魚(, BAA92339.2)以及尖頭鱥(, AAF63689.1)等的同源性高達99%。通過MEGA-X的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹(圖2),actin和分別聚為兩大支。本研究克隆的赤眼鱒actin與鯉科魚類的actin聚為一支, 鱸形目的羅非魚與石鯛(, ACR56337.1)聚為一支, 軟體動物的蝸牛(, AXI69344.1)和三角帆蚌(, ADG266 59.1)聚為一支, 哺乳類大嘴烏鴉(, BAJ07872.1)、家麻雀(, AAR00510.1)和綠猴(, BAA20266.1)聚為一支, 表明本研究克隆所得actin基因分類地位與物種進化地位一致。

圖2 NJ系統(tǒng)進化樹

2.3 β-actin蛋白的理化性質分析

運用ExPASy Proteomics Server-ProtParam在線服務軟件分析赤眼鱒actin氨基酸理化性質表明, 分子式為C1850H2903N491O562S23; 不穩(wěn)定系數(shù)為35.25小于40, 表明該蛋白是穩(wěn)定的, 總平均親水性為-0.213, 脂肪系數(shù)為81.41。親水性氨基酸殘基包括C、N、Q、S、T和Y, 共105個, 占氨基酸含量的27.9%, 疏水性氨基酸殘基共186個, 占氨基酸含量的49.6%, 包括A 、F、G、I、L、M、P、V和W, 由此可得actin蛋白為疏水蛋白。

2.4 β-actin蛋白結構分析

經(jīng)信號肽預測和蛋白質分析表明該蛋白為無信號肽、非跨膜蛋白。二級結構預測結果表明該蛋白由9個-螺旋和15個片層結構組成-螺旋和-片層結構規(guī)則不易變形, 可作為蛋白質骨架起穩(wěn)定作用[24–25]。對赤眼鱒actin氨基酸序列進行同源三級結構建模,模型構建的氨基酸范圍從第2個氨基酸到第375個氨基酸, 其建模參考模板為原雞肌動蛋白, 目標蛋白與參考蛋白的序列比對同源性為99.20%, 模型評估=0.99 , 模型中可見典型的-螺旋結構(圖3)。

圖3 SWISS-MODEL預測赤眼鱒β-肌動蛋白同源三級結構模型

2.5 赤眼鱒β-actin基因組織表達差異

以赤眼鱒EF1基因為參照, 利用qPCR技術測得赤眼鱒actin基因在肌肉、腸、脾臟、皮膚、血液、鰓、體腎、頭腎、心臟和肝臟組織中都有表達(圖4)。赤眼鱒actin基因在肌肉和腸組織中相對表達量較高, 且顯著高于其他8個組織; 肝臟中表達量最低, 且顯著低于其他9個組織。

圖4 赤眼鱒β-actin基因的組織表達

注: 字母相同為差異不顯著, 字母不同為差異顯著。

2.6 β-actin的穩(wěn)定性分析

利用Best Keeper軟件計算得到actin與EF1兩個基因的CP最小值(min)、CP最大值(max)、相關系數(shù)()、標準偏差(SD)和變異系數(shù)(CV),actin的三個數(shù)值均高于EF1, 相關系數(shù)兩者相差不大, 但EF1的標準偏差和變異系數(shù)均顯著小于actin(表2)。根據(jù)Best Keeper軟件穩(wěn)定性的判定標準[26], 綜合可得, EF1的穩(wěn)定性高于actin, EF1更適合作為赤眼鱒的內參基因。

表2 Best keeper軟件穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)

3 討論

本實驗通過RT-PCR技術和RACE法克隆得到赤眼鱒actin基因cDNA序列, 該基因cDNA全長共1 816 bp, 由長94 bp的5’端非編碼區(qū), 長594 bp的3’端非編碼區(qū)和長1 128 bp的開放閱讀框(95-1222)組成, 閱讀框共編碼375個氨基酸。與NCBI上登陸的鰱魚(, AAG17452.1)、綠猴 (, BAA20266.1)、泥鰍(, AAG48576.1)和紅原雞(, AAA98527.1)等的actin氨基酸序列對比時發(fā)現(xiàn),actin的閱讀框編碼的氨基酸均在375個左右, 與胡松年等[27]在多種真核生物中綜合分析所得出結論一致。

近年來有關actin基因的研究表明, 該基因在不同生物體內組織表達存在差異。一方面, 作為公認的內參基因,actin基因在一些物種中的組織表達水平是一致的, 如寬體沙鰍()的actin基因在檢測的11個組織都有表達, 且表達量一致[28]; 三角帆蚌的actin基因在檢測的8個組織的表達量基本一致, 較穩(wěn)定[5]。另一方面actin基因在不同組織內表達量存在明顯差異, 如大鱗副泥鰍()[8]actin基因在卵巢內有較高的表達, 腸表達量較低;actin基因在擬穴青蟹肌肉組織中的表達量最高, 在結締組織中的表達量最低[29]。本研究赤眼鱒actin基因在各組織中均有表達, 但各組織內的表達存在差異, 在肌肉、腸中相對表達量較高。腸的主要組成結構是平滑肌, 肌肉組織更是由大量的肌細胞組成, 因此actin基因可能在赤眼鱒體內主要發(fā)揮支持細胞運動的功能。

實時熒光定量PCR技術(qPCR)因其定量準確、實時監(jiān)測以及自動化高等優(yōu)點而被廣泛運用于生物基因表達分析、醫(yī)學診斷和環(huán)境監(jiān)測等方面[30]。actin基因作為管家基因的一員, 在生物體內表達廣泛且穩(wěn)定, 具高度保守性, 在許多水產(chǎn)動物的分子生物學研究中都用作參照基因, 如鱖魚()[31]等。本研究采用常用的穩(wěn)定性分析軟件Bestkeeper對赤眼鱒EF1基因和赤眼鱒actin基因進行了穩(wěn)定性分析, 得出了CV、SD和等數(shù)據(jù),actin基因的相關系數(shù)雖然較EF1基因高, 但標準偏差和變異系數(shù)均遠大于EF1基因, 綜合得actin基因的穩(wěn)定性不如EF1基因。在本次檢測中赤眼鱒體內的兩個基因的標準偏差均大于1, 說明兩個基因均不穩(wěn)定, 作為內參基因時可能存在一定誤差。本研究的actin基因和EF1基因的穩(wěn)定性分析具有一定的限制性, 可能在不同生物體內, 以及不同的外界刺激和生理條件下穩(wěn)定性會發(fā)生改變, 因此赤眼鱒的最佳內參基因的篩選存在一定難度。

4 結論

本研究首次克隆得赤眼鱒actin基因cDNA全長, 并探究了其序列特征及其表達特點。該基因全長共1 816 bp; 且氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)鯉科魚類親緣關系近, 與哺乳動物親緣關系較遠; 在肌肉、腸組織內表達量最高; 表達穩(wěn)定性不如赤眼鱒EF1基因, 因此EF1基因更適合作為赤眼鱒的內參基因。以上結果為篩選赤眼鱒其他基因量化、分子研究的內參基因提供了actin基因和EF1基因的基礎數(shù)據(jù)。

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Cloning, expression and stability analysis ofgene in squaliobarbus curriculus

Chen Lei, Chen Shuyi, Zhou Gang, Huang Yuhong, Li Wei, Wang Jing’an, Xiao Tiaoyi, Liu Qiaolin

(Hunan Engineering Technology Research Center of Featured Aquatic Resources Utilization, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To investigate the structure and expression characteristics of beta-actin (actin) gene in,the full length sequence ofcDNA is cloned from the liver by the way of RT-PCR and RACE (GenBank: MT119965). The full length is 1816 bp, which consists of a 94 bp 5’ untranslated region (UTR), a 594 bp 3’ UTR and an 1128 bp open reading frame (95-1222). And there are 375 amino acids in the translated protein. The phylogenetic tree shows thatactin ofgathers into one branch with Cyprinidae. And sequence analysis reveals that the homology ofactin amino acids with,andand other species is 99%, which suggestesactin gene is highly conserved in fish. The expression analysis of qPCR shows thatactin is expressed in 10 tissues including muscle, intestine, spleen, skin, blood, gill, body kidney, head kidney, heart and liver, but the expression level ofactin is different among these tissues. The stability of the EF1 (elongation factor 1) andactin inis compared by the Best Keeper software. EF1 gene is more stable.The above research provides evidence for the evolution of the molecular system and a reference for the study of the gene expression of.

;actin; gene clone; tissue expression; stability

Q 785

A

1672–6146(2020)03–0036–07

10.3969/j.issn.1672–6146.2020.03.007

劉巧林, qiaolinliu2017@hunau.edu.cn。

2020–5–10

國家自然科學基金青年項目(31402289); 湖南省自然科學基金青年項目(2018JJ3221); 湖南農(nóng)業(yè)大學雙一流建設項目(SYL201802020)。

(責任編校: 郭冬生)