謝 麗 彭鳳蘭

長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南省寧鄉(xiāng)縣 410600

精子發(fā)生需要經(jīng)歷復(fù)雜而有序的一個過程，在發(fā)育階段的特異性基因表達(dá)以及調(diào)控屬于正常精子得以形成的分子基礎(chǔ)[1]。目前，通過對不同基因修飾小鼠模型展開深入研究，已經(jīng)鑒定出了400余個與精子發(fā)生異常具有一定關(guān)系的基因，表明多種基因在精子發(fā)生過程中會出現(xiàn)特異性表達(dá)，并且具有功能，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)理尚需展開深入研究[2]。miR-125b是miR-125家族中的一員，已被證實在不同生物過程中起著重要的作用，分析和鑒定生精細(xì)胞中miR-125b中靶基因，對于研究miR-125b對生精細(xì)胞的影響有重要意義[3]。p53為凋亡基因中第一種，研究發(fā)現(xiàn)生精細(xì)胞中miR-125b的靶基因可能為p53[4]。但miR-125b在生精細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及機(jī)制尚不明確，因此本課題通過對小鼠生精細(xì)胞培養(yǎng)模型，探究miR-125b靶向調(diào)節(jié)p53表達(dá)對生精細(xì)胞發(fā)育能力的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取出生7d的清潔級健康小鼠，購于北京實驗動物中心，此次試驗嚴(yán)格參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》中的規(guī)定流程展開，且符合倫理要求。

1.1.2 實驗藥品及器材：細(xì)胞培養(yǎng)基由Hyclone公司提供；磷酸緩沖鹽溶液均購于武漢博士德生物工程有限公司；膠原酶Ⅳ以及胰酶均購于Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽由Beyotime Biotechnology 公司提供；二甲基亞砜由Ameresco公司提供。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)支持細(xì)胞：以頸椎脫臼法將小鼠處死，無菌取出睪丸，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，以磷酸緩沖鹽溶液對睪丸表面附著的血液進(jìn)行沖洗后，倒入新磷酸緩沖鹽溶液，以鑷子、剪刀對小鼠白膜進(jìn)行去除，并剪碎睪丸，以2g/L膠原酶Ⅳ及2g/L胰酶依次對睪丸組織進(jìn)行低溫下消化。予以離心后，取上清液，再制備單細(xì)胞懸液，將其接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，2h即可，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，對培養(yǎng)基進(jìn)行置換，予以培養(yǎng)過夜，并對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行定期觀察，對細(xì)胞培養(yǎng)基及時更新，待細(xì)胞達(dá)到單層鋪滿狀態(tài)后，以磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行3次清洗，予以胰酶消化，以計數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，并重新接種。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽法測定細(xì)胞增殖：以四甲基偶氮唑鹽法對96孔板中的細(xì)胞接種數(shù)量進(jìn)行控制，維持1×105個/L，并于每組中均設(shè)置為5個重復(fù)，各孔的接種量控制為200μl。對96孔板進(jìn)行輕柔晃動，于37℃環(huán)境中放置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)予以培養(yǎng)2d后取出，分別于每孔中加入20μl四甲基偶氮唑鹽，搖勻后置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)再次予以4h培養(yǎng)，將上清液去除后，于每孔中加入150μl 二甲基亞砜，以酶聯(lián)免疫檢測儀對490nm處的吸光度進(jìn)行測定。

1.2.3 免疫印跡試驗：于6孔板中對250μl支持細(xì)胞進(jìn)行接種，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2d，待胰酶消化，對細(xì)胞進(jìn)行收集，以磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行清洗，并離心處理，取沉淀組織，對細(xì)胞進(jìn)行低溫裂解，經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.4 實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：于6孔板中對250μl支持細(xì)胞進(jìn)行接種，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)到單層覆蓋后，提取RNA，予以反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，對p53進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理 以GraphPad Prism 5軟件對四甲基偶氮唑鹽法和實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-125b對支持細(xì)胞的影響 給予小鼠原代支持細(xì)胞組織相應(yīng)對照、轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor及miR-125b mimic后，予以實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，發(fā)現(xiàn)miR-125b過表達(dá)且被敲低，見圖1-①。經(jīng)四甲基偶氮唑鹽法與免疫印跡試驗，顯示轉(zhuǎn)入miR-125b mimic后，小鼠的支持細(xì)胞增殖能力明顯增加，見圖1-②；而轉(zhuǎn)入miR-125b inhibitor后，小鼠的支持細(xì)胞增殖能力明顯衰退，見圖1-③。

2.2 miR-125b對p53表達(dá)的影響 免疫印跡試驗及實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor對于p53表達(dá)起著促進(jìn)作用，而miR-125b mimic對p53表達(dá)起著抑制作用，見圖2。

2.3 p53表達(dá)對支持細(xì)胞的影響 于小鼠支持細(xì)胞中進(jìn)行p53 小干擾RNA-1、2、3轉(zhuǎn)染，并以實時熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小干擾RNA-2及小干擾RNA-3對于p53表達(dá)的沉默效果十分顯著，見圖3-①，再對小干擾RNA-3細(xì)胞組織進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽試驗，發(fā)現(xiàn)敲低p53后，小鼠的支持細(xì)胞增殖能力會明顯升高，見圖3-②。

3 討論

近年來，隨著社會化工業(yè)化程度的進(jìn)一步提高，環(huán)境污染問題愈發(fā)嚴(yán)重，不孕不育發(fā)生率不斷升高，已成為影響人類社會的常見病癥[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，育齡夫婦中，不孕不育的發(fā)生率已達(dá)到10%～15%，其中由男方因素所致不孕不育的占有比為50%，且大多患者的病因、發(fā)病機(jī)制并未明確。精子發(fā)生是一個十分高效的過程，正常情況下，健康男子平均每秒可產(chǎn)生數(shù)千顆精子，然而僅少數(shù)精子的形態(tài)正常，并且還呈現(xiàn)出逐年下降趨勢[7]。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，男性不育問題愈加嚴(yán)重，即將發(fā)展為僅次于腫瘤及心腦血管病的第三大疾病，且會成為生殖健康領(lǐng)域工作研究中的重要項目[8]。

圖1 miR-125b促進(jìn)支持細(xì)胞組織增殖

圖2 miR-125b下調(diào)p53表達(dá)

圖3 p53促進(jìn)支持細(xì)胞組織增殖

當(dāng)前，隨著以體外受精技術(shù)為代表的現(xiàn)代化新型輔助生殖技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與完善，不育癥患者已獲取到擁有自己后代的機(jī)會，盡管生殖醫(yī)學(xué)新時代已經(jīng)到來，但是各種輔助性受孕技術(shù)繞過了受精過程中對潛在具有遺傳缺陷的異常精子的自然選擇機(jī)制，因此可能使后代遺傳缺陷[9]。鑒于此，對男性不育的發(fā)生因素以及分子機(jī)制展開深入分析，并根據(jù)分析結(jié)果提出切實可行的診治措施顯得尤其關(guān)鍵。microRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的短片段，已逐漸成為生物學(xué)中的研究重點，miRNA可與靶基因mRNA產(chǎn)生相互作用，使靶基因mRNA的穩(wěn)定性有效降低，在細(xì)胞增殖、發(fā)育及分化等過程中均起著關(guān)鍵性作用[10-11]。研究[12]表明，男性生精細(xì)胞組織內(nèi)存在大量miRNAs表達(dá)，且對精原細(xì)胞組織分析及自我更新產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。miR-125b屬于miR-125家族成員，有2個前體，即pre-miR-125b-1以及pre-miR-125b-2，其編碼基因分別位于11號和21號染色體上[13]。本次研究通過創(chuàng)建小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-125b可使p53表達(dá)下調(diào)，p53表達(dá)是miR-125b的靶基因。將p53的小干擾RNA轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)p53基因沉默可對支持細(xì)胞組織增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用。miR-125b能夠下調(diào)BMF，而BMF屬于Bcl-2屬于促凋亡家族中的成員，當(dāng)BMF下調(diào)后，對于細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞增殖均可起到促進(jìn)作用，因此miR-125b表達(dá)表現(xiàn)出組織器官差異性特征，通過對細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的p53基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，促使細(xì)胞的增殖及凋亡能力發(fā)生變化，提高生精細(xì)胞發(fā)育能力[14-15]。

綜上所述，miR-125b通過靶向調(diào)節(jié)p53表達(dá)，從而促進(jìn)生精細(xì)胞發(fā)育能力的提升。