于辛酉，閆亞萍，謝 峰，鄭丹丹，閆寶蘭

22q11.2 微缺失綜合征(OMIM:611 867)是最常見的染色體微缺失綜合征之一，為常染色體顯性遺傳，約90%為新發(fā)，其發(fā)生率為 1/4 000～1/6 000 活產(chǎn)嬰兒，包括腭心面綜合征(VCFS) 和Di George綜合征[1]。臨床表現(xiàn)多樣，主要有先天性心臟病、免疫缺陷、腭裂畸形和特殊面容等[2-4]，給其自身、家庭以及社會帶來深重的負(fù)擔(dān)。本研究探討22q11.2 微缺失綜合征的臨床特征及在本地區(qū)發(fā)病情況，為該病的遺傳學(xué)診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:本研究對象為2014年4月-2019 年4月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院，通過臨床癥狀、體格檢查、B超、實驗室檢測等評估的具有先天性心臟病(CHD)、嚴(yán)重感染、低鈣血癥、唇腭裂等患兒 77 例。向父母提供知情同意書并獲簽字同意后，抽取患兒靜脈血5 mL 于 EDTA抗凝管中，-20 ℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA提取:取患兒肘靜脈200 μl，采用 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)試劑盒，按照說明書操作提取DNA，測定所提DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，計算 DNA 濃度及純度，要求 A260/A280 在1.8～2.0。使用pH為8.0的TE緩沖液將DNA稀釋至終質(zhì)量濃度為50 mg/L。

1.2.2 染色體芯片(CMA)檢測:CMA的檢測按照美國 Affymetrix公司生產(chǎn)的Cytoscan 750K芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，應(yīng)用配套的ChAS軟件及生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分析流程參照美國ACMG的指南進(jìn)行。

1.2.3 MLPA分析:采用荷蘭 MRC Holland 公司 MLPA Mental Retardation-1 試 劑 盒(SALSA P324),含40個擴(kuò)增產(chǎn)物大小為130～463 nt的探針。這40個探針主要為分布在染色體 22q11.2關(guān)鍵區(qū)域的29個探針及11個內(nèi)參探針，覆蓋約2 Mb的范圍。MLPA操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,首先將基因組 DNA變性5 min，然后和探針混勻，再次變性1 min后雜交 16 h，用連接酶連接15 min，孵育 5 min后 終止反應(yīng)，最后PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI 3100 測序儀進(jìn)行片段分析。所得數(shù)據(jù)采用 Coffalyser.Net軟件進(jìn)行處理，參考探針正常比值范圍為0.7～1.3。

1.2.4 染色體核型分析：G帶核型分析，取0.3 mL外周血接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)72 h，加入終濃度為秋水仙素后置于培養(yǎng)箱2 h后收獲細(xì)胞。將培養(yǎng)物吸入離心管， 離心后棄去上清液，加入KCl溶液低滲， 37 ℃水浴25 min，隨后加入卡諾固定液預(yù)固定10 min后重復(fù)固定 2 次制片。玻片置于75 ℃烤箱中3 h后取出，用 胰蛋白酶消化約1～2 min 后， 吉姆薩染液染色進(jìn)行G顯帶。采用染色體核型分析系統(tǒng)進(jìn)行計數(shù)分析，同時參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況:77例患兒中CHD 50例(64.9%)，室間隔缺損24例(31.1%)，法洛四聯(lián)癥13例(16.9%),房間隔缺5例( 6.5%)，肺動脈閉鎖5例(6.5%)，主動脈弓離斷3例(3.9%)。另外，還有低鈣血癥16例(20.1%)，嚴(yán)重感染6例(7.8%),CHD合并感染、低鈣血癥、唇腭裂等5例(6.5%)。

2.2 CMA檢測:77例患兒中，檢出 22q11.2 缺失11例，占14.3%；其中先天性心臟病8例，3例表現(xiàn)為低鈣血癥。剩余 66例患兒未檢測到異常，占85.7%。所有陽性標(biāo)本均進(jìn)行了 3次重復(fù)實驗，所得結(jié)果一致，見表1。

表1 22q11.2微缺失綜合征檢測結(jié)果分析[n(%)]

2.3 MLPA檢測：將CMA檢測所得11例陽性結(jié)果進(jìn)行MLPA驗證，結(jié)果均一致。

2.4 核型分析：77例患兒核型分析結(jié)果均為正常。

3 討論

22q11.2微缺失綜合征臨床表型幾乎涉及機(jī)體各個部分，即使在同一家系的患者中也具有表型異質(zhì)性。常見癥狀及體征包括CHD、特殊面容和腭裂，免疫缺陷和自身免疫病也較多見[5]。本研究11例患者中，CHD的發(fā)病率為72.7%，其中室間隔缺損占50%(4/8),法洛四聯(lián)癥患占25%(2/8)，肺動脈閉鎖占12.5%(1/8)，主動脈弓離斷占12.5%(1/8)明顯低于上述研究。有研究表明75%～85%的22q11.2微缺失綜合征都有先天性血管畸形[2，6]。本研究所得結(jié)果略低于此數(shù)據(jù)，可能由于所納入樣本量不足所致。但從22q11.2微缺失綜合征的各個臨床表現(xiàn)發(fā)生率分析，本文中CHD仍是發(fā)生率最高的臨床癥狀，與國內(nèi)外研究一致。22q11.2微缺失綜合征中的心血管畸形多以心臟圓錐干異常為主[7- 8]，本研究病例中有50%為室間隔缺損室，也符合該病的臨床表現(xiàn)。本研究非圓錐動脈干畸形中未發(fā)現(xiàn)合并22q11.2微缺失。出現(xiàn)差異的原因考慮為本地區(qū)的經(jīng)濟(jì)社會原因，多數(shù)復(fù)雜畸形患者未能進(jìn)行進(jìn)一步檢測，轉(zhuǎn)診至上級醫(yī)院或放棄治療，使的本組研究中圓錐動脈干畸形患者病例數(shù)比例偏低。在今后的研究中將擴(kuò)大樣本量，以便更加準(zhǔn)確地反映22q11.2微缺失綜合征在本地區(qū)的CHD患者中發(fā)病情況。

CHD是我國最常見、亦是最嚴(yán)重的先天性畸形之一?！吨袊錾毕莘乐螆蟾妗凤@示，2011年全國出生缺陷監(jiān)測系統(tǒng)統(tǒng)計的圍生期CHD發(fā)病率高達(dá)40.95/萬，占出生缺陷的首位?；加蠧HD的新生兒如果未進(jìn)行及時的干預(yù)和治療，大約有1/3會在出生后1個月內(nèi)因嚴(yán)重的病情和畸形而夭折，及早進(jìn)行相關(guān)遺傳學(xué)診斷，明確病因，對于患兒預(yù)后指導(dǎo)及家庭的再生育風(fēng)險評估具有極大意義。

部分22q11.2微缺失綜合征患兒存在嚴(yán)重感染、低鈣血癥等癥狀[9]，本研究3例患兒臨床表現(xiàn)為首發(fā)癥狀，這與張莉等人[10]報道一致。免疫問題是除CHD外最常見的22q11.2癥狀。由于該綜合征的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性，本文中的11例患兒表現(xiàn)不盡相同。目前研究發(fā)現(xiàn)[8，11-12]，22q11.2微缺失綜合征是由染色體22q11.2區(qū)域重排導(dǎo)致，90%的缺失片段大小為3 Mb,包含30～40個基因。目前已經(jīng)確定的TBX1基因的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控發(fā)育過程，與心臟畸形、腭裂、甲狀旁腺功能不全等相關(guān)[13-15]。本研究檢測11例患兒缺失片段大小平均約為3.0 Mb，缺失區(qū)域覆蓋該綜合征的典型區(qū)域，含有關(guān)鍵基因-TBX1。還需要積累更多數(shù)據(jù)明確基因型與表型間的關(guān)系，從而進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)理。

從出生缺陷防控角度出發(fā)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為凡是CHD患者均應(yīng)進(jìn)行22q11.2微缺失檢測[16]。22q11.2 微缺失綜合征呈常染色體顯性遺傳，其生育患兒的風(fēng)險為50%，因此，如果發(fā)現(xiàn)患該病時，應(yīng)對其父母進(jìn)行檢測。本研究11例患兒父母均拒絕進(jìn)行相應(yīng)的檢測，無法評估其再生育風(fēng)險，建議直接進(jìn)行產(chǎn)前診斷。