汪玉海，王志斌，張小鈺，金麗娟

骨質(zhì)疏松的發(fā)生與年齡、性別、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)，絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏、骨質(zhì)疏松的發(fā)病率明顯增加，絕經(jīng)后女性也被認(rèn)為是發(fā)生骨質(zhì)疏松的高危人群[1-3]。雌激素在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性，絕經(jīng)后女性雌激素缺乏引起骨質(zhì)疏松的可能機制包括[4-6]：抑制成骨細(xì)胞分化、促進破骨細(xì)胞分化，使成骨活性超過破骨活性中導(dǎo)致骨量不斷丟失；刺激多種炎癥細(xì)胞因子的釋放、破壞骨代謝平衡并引起骨量丟失；激活細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖并使成骨細(xì)胞的數(shù)目減少、引起骨量丟失。因此，對骨代謝過程進行干預(yù)是目前治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要靶點[7-8]。脂肪干細(xì)胞，已經(jīng)被證實能夠向成骨細(xì)胞分化并用于骨質(zhì)疏松模型大鼠的治療[9-10]，且與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比較，具有來源豐富、取材簡單、獲得率高等優(yōu)勢[12-13]，但脂肪干細(xì)胞移植用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠治療的價值及機制均未明確。通過雙側(cè)卵巢切除法建立了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型，研究脂肪干細(xì)胞移植對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、骨形態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本實驗于2016年6-12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)完成。選取3月齡SD 雌性大鼠42只，體重(180±20)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(寧)2015-0001。

1.2 實驗材料：大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(南京科佰生物科技有限公司)液氮內(nèi)冷凍保存，小牛血清(甘肅民海生物公司)，胰蛋白酶(美國SIGMA公司)，骨密度儀(美國GE公司)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司)，HE染色試劑盒(上海碧云天公司)，

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液的制備：脂肪干細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM進行貼壁培養(yǎng)，密度生長至90%后用胰蛋白酶消化、以1∶3傳代繼續(xù)培養(yǎng)；收集第4代脂肪干細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度至2×107/mL，按照100 μl/管分裝細(xì)胞。

1.3.2 大鼠模型建立：將大鼠分為假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松對照組、骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞移植組。

1.3.2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型建立：32只SD雌性大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，腹部正中縱行切口逐層切開，找到卵巢絲線結(jié)扎后摘除，逐層縫合后任其自由活動。喂養(yǎng) 12 周后通過雙能X線吸收儀(DEXA)骨密度法測量SD大鼠脊柱全長的骨密度，確定造模是否成功，選取造模成功的26只大鼠進入實驗。

1.3.2.2 假手術(shù)組大鼠模型建立：10只SD雌性大鼠按照相同的方法麻醉并將脂肪團拉出，僅切除卵巢附近的脂肪組織適量、不摘除卵巢。常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3.3 脂肪干細(xì)胞移植：造模成功的26只大鼠以1.6∶1分為骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞移植組16只與骨質(zhì)疏松10只。脂肪干細(xì)胞移植組將100 μl細(xì)胞密度為2×107/mL的脂肪干細(xì)胞懸液進行尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)8周；骨質(zhì)疏松對照組和假手術(shù)組給予生理鹽水100 μl尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)8周。

1.3.4 指標(biāo)測定：飼養(yǎng)至第8周，分別處死骨質(zhì)疏松組、脂肪干細(xì)胞移植組、假手術(shù)組大鼠，完整取出股骨，剔除肌肉，先行雙能X線骨密度測定，后行骨形態(tài)學(xué)測定。右側(cè)股骨行測量總組織面積、骨小梁面積、骨小梁周長，按照骨小梁面積/總組織面積×100%骨小梁面積百分比(2/1.99)×(骨小梁面積/骨小梁周長)計算骨小梁厚度、(總組織面積-骨小梁面積)/骨小梁周長計算骨小梁間距等骨形態(tài)學(xué)測定。骨礦鹽測定：左側(cè)股骨放入105 ℃烤箱中烘烤5～6 h，達恒重后稱量干重，而后將烤干后的股骨放入650 ℃的灰化爐中灰化36 h，稱量灰化后樣品的重量，灰化后重量與干重之比為礦物質(zhì)鹽的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度的比較：與骨質(zhì)疏松組比較，脂肪干細(xì)胞移植組大鼠左側(cè)股骨及右側(cè)股骨的骨密度均明顯升高(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，骨質(zhì)疏松組左右兩側(cè)股骨的骨密度明顯降低(P<0.05)；與骨質(zhì)疏松組比較，脂肪干細(xì)胞移植組兩側(cè)股骨的骨密度明顯增高(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠骨密度的比較

2.2 3組大鼠骨形態(tài)的比較：與假手術(shù)組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠右側(cè)股骨中的骨小梁面積百分比、骨小梁厚度明顯降低，骨小梁間距明顯增加(P<0.05)；與骨質(zhì)疏松組比較，脂肪干細(xì)胞移植組大鼠右側(cè)股骨的骨小梁面積百分比、骨小梁厚度明顯增加，骨小梁間距明顯降低(P<0.05)，見圖1-圖3(目錄后)。

2.3 3組大鼠骨組織中礦物質(zhì)鹽含量的比較：假手術(shù)組左側(cè)股骨中礦物質(zhì)鹽含量為(0.412±0.075)g/g，骨質(zhì)疏松組為(0.247±0.045)g/g，骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞移植組為(0.352±0.068)g/g，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.04，P<0.05)。骨質(zhì)疏松組與假手術(shù)組比較，礦物質(zhì)鹽的含量明顯降低(P<0.05)；與脂肪干細(xì)胞組比較，骨質(zhì)疏松組礦物質(zhì)鹽的含量明顯降低(P<0.05)。

3 討論

骨質(zhì)疏松發(fā)病的根本原因是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成過程及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程平衡的打破。雌激素對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、增殖均具有調(diào)控作用，絕經(jīng)后雌激素的缺乏通過影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞來引起骨代謝異常、造成骨量丟失并引發(fā)骨質(zhì)疏松[14-16]。近年來，組織工程技術(shù)在骨質(zhì)疏松治療中的價值受到了越來越多的關(guān)注，具有多項分化潛能的干細(xì)胞是治療骨質(zhì)疏松理想的組織工程種子細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞是目前臨床上使用較為廣泛的干細(xì)胞類型，兩種均被證實具有成骨分化的潛能，并且已有研究證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠使骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度增加、骨形態(tài)改善[9-10]，但脂肪干細(xì)胞移植用于骨質(zhì)疏松大鼠治療的研究并不多。脂肪干細(xì)胞具有來源廣泛、擴增能力強、獲得率高、倫理限制少的優(yōu)勢，是更為理想的種子細(xì)胞。

目前公認(rèn)的與臨床最相似的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型是采用去勢法構(gòu)建的去卵巢大鼠模型,因其造模成功率高、方法簡便，故得到了廣泛應(yīng)用[11]。美國食品與藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為，去卵巢大鼠為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的最佳動物模型。因此本研究采用此法將雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢切除，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型。

實驗結(jié)果與假手術(shù)組相比，骨質(zhì)疏松模型大鼠兩側(cè)股骨的骨密度均明顯降低，骨形態(tài)表現(xiàn)為骨小梁面積百分比、骨小梁厚度的降低以及骨小梁間距的增加，說明骨質(zhì)疏松模型大鼠發(fā)生了骨量丟失以及骨形態(tài)改變，印證了通過摘除雌性大鼠雙側(cè)卵巢可以成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型；在造模后通過移植脂肪干細(xì)胞，實驗結(jié)果中脂肪干細(xì)胞組的骨密度、骨小梁面積百分比、骨小梁厚度均明顯高于骨質(zhì)疏松模型組，骨小梁間距明顯低于骨質(zhì)疏松模型組，說明脂肪干細(xì)胞移植能夠使絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度增加、骨形態(tài)得到改善，同時在移植脂肪干細(xì)胞后，骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中礦物質(zhì)鹽的含量明顯增加，說明脂肪干細(xì)胞對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨代謝具有改善作用。本實驗結(jié)果證實，移植進入機體內(nèi)的脂肪干能夠糾正成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞失衡的狀態(tài)，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨代謝具有改善作用，并能增加骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度、改善骨形態(tài)。

本研究證實，脂肪干細(xì)胞移植可以增加骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，改善骨形態(tài)，并能提高骨礦鹽含量。本研究不足之處是脂肪干細(xì)胞是通過何種作用機制、通過何種分子通道發(fā)揮前述作用的，還需要進一步研究。