魏秀彩 劉金棟 劉利成 黎用朝 潘孝武 董錚 劉文強 熊海波 閔軍 李小湘 , *

(1湖南大學研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2湖南省農(nóng)業(yè)科學院 水稻研究所, 長沙 410125; 3 中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)基因組研究所, 深圳 518124;4農(nóng)業(yè)部長江中下游秈稻遺傳育種重點實驗室, 長沙 410125; #共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: xiaoxiang66196@126.com)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)育著全世界半數(shù)以上的人口。我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)和消費國之一。近 30年來，由于全球人口快速增長，氣候急劇變化、城市化建設(shè)和鹽堿地面積擴張導致人均可耕地面積迅速減少，嚴重威脅全球糧食安全。預(yù)計到 2030年，我國糧食缺口將達到1.5億t。高產(chǎn)是當前和今后水稻育種的主導目標[1]。雖然化肥的大量施用可有效提升稻米產(chǎn)量，但同時也會對自然生態(tài)環(huán)境帶來嚴重威脅。發(fā)掘水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀位點及其關(guān)聯(lián)標記，篩選攜帶大量優(yōu)異等位基因的重要種質(zhì)，通過分子標記輔助選擇的方法選育高產(chǎn)品種，是提升水稻產(chǎn)量，維護糧食安全最為經(jīng)濟、有效且環(huán)保的方法。

水稻產(chǎn)量性狀是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，受環(huán)境影響顯著。水稻的產(chǎn)量性狀主要包括單株有效穗數(shù)、單穗粒數(shù)和千粒重。抽穗期是水稻重要農(nóng)藝性狀之一，抽穗期（播種至抽穗期的時間）是水稻生育期長短的直接反應(yīng)。適宜的抽穗期可使植株在特定的生態(tài)條件下最大程度地利用當?shù)氐墓鉄豳Y源，決定了水稻適宜種植的區(qū)域和時間[2]。迄今為止，已有多項研究針對水稻抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀遺傳機制解析展開。在水稻抽穗期方面，Ehd1、Hd3a、RFT1、RID1、SDG724、Ehd4 等已被克隆QTL/基因能夠誘導植株提早抽穗，DTH7、Ghd7、EL1和DHD1等負調(diào)控因子能延遲水稻開花。關(guān)于產(chǎn)量構(gòu)成因子，正向調(diào)控水稻產(chǎn)量的有GIF1、GS5、GS2、GLW7、DEP1、DST、GNP1 和 NOG1等；負向調(diào)控水稻產(chǎn)量的有PROG1、D53、GS3、GW2、qGL3、qTGW3和An-1等。除此之外，還有數(shù)十個抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)的基因/QTL被發(fā)掘[3]。然而，水稻產(chǎn)量性狀遺傳機制十分復(fù)雜，尚未完全解析。亟需發(fā)掘新的產(chǎn)量相關(guān)基因為育種提供參考。

連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association analysis，GWAS）是挖掘微效基因的兩種主要方法。長期以來，水稻遺傳學研究主要采用雙親群體開展連鎖分析。連鎖分析以雙親群體為材料，遺傳背景簡單且定位結(jié)果可靠，但也存在一定局限性。連鎖分析具有構(gòu)建雙親群體耗時長，成本偏高，雙親群體遺傳背景單一，無法反映自然界廣泛存在的遺傳變異的弊端。相較于連鎖分析，基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析則具有成本低、效率高且來源廣泛，可反映自然界廣泛存在的遺傳變異的優(yōu)點。但是 GWAS也有采用材料存在顯著的親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)，關(guān)聯(lián)結(jié)果假陽性高且稀有等位變異檢出率低、準確性低的缺點[4]。近年來，多親本重組自交系群體(multi-parent advanced generation inter-crosses population, MAGIC)的出現(xiàn)則在一定程度上彌補了二者的缺陷。MAGIC群體是由多親本的雜交和多代的互交構(gòu)建而來的新一代作圖群體。Bandillo等[5]利用來自于中國、哥倫比亞、國際水稻研究所等國家或組織的8個秈稻和8個粳稻優(yōu)良品種(系)經(jīng)過多年多代雜交構(gòu)建了 4個 MAGIC群體，即秈稻MAGIC群體(8個秈稻親本)、MAGIC Plus群體(8個秈稻親本和2個額外的8秈稻親本互交的F1)、粳稻MAGIC群體(8個粳稻親本)、Global MAGIC群體(16個親本：8個秈稻和8個粳稻親本)。隨后，利用這些MAGIC群體，針對抽穗期、株高、粒長、粒寬、直鏈淀粉含量、耐鹽性、耐淹性、稻瘟病及白葉枯病抗性等方面進行了連鎖分析[5-7]。這些群體在長沙抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀的表現(xiàn)型評價及全基因組關(guān)聯(lián)分析未見報道。

本研究以 Bandillo等[5]所構(gòu)建的 8親本MAGIC-Hei群體為材料，連續(xù)兩年在湖南省水稻研究所長沙馬坡嶺試驗田開展抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀鑒定，基于基因分型（GBS）測序技術(shù)獲得基因型，通過 GWAS發(fā)掘水稻抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)位點，篩選攜帶有利等位基因的優(yōu)良株系，以期為分子標記輔助育種提供新基因和優(yōu)異種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料種植及農(nóng)藝性狀調(diào)查

將MAGIC-Hei群體的8個親本[Fedearroz 50，Shan-Huang Zhan-2 （SHZ-2），IR64633-87-2-2-3-3(PSBRc82)，IR4630-22-2-5-1-3，IR45427-2B-2-2B-1-1，IR84196-12-32(SAMBHA MAHSURI+SUB1)，IR77298-14-1-2-10，IR77186-122-2-2-3(PSBRc 158)]及其395個株系MAGIC群體分別于2017年和2018年5月底種植在湖南省水稻研究所馬坡嶺試驗基地。播種25 d后單本移栽，每份材料種植3行，10株/行，株行距為20.0 cm×26.4 cm，兩次重復(fù)。記載抽穗期（單株系全小區(qū)50%稻穗抽穗時），田間肥水管理按照當?shù)匾患就淼菊７N植管理技術(shù)進行，及時防治病蟲害。

水稻齊穗后30 d，按抽穗期不同，分批收獲每個材料中間行的 3株稻穗，分別裝袋，兩次重復(fù)。收獲后將穗子置于45℃烘箱中烘72 h，對單株有效穗數(shù)（number of tillers per plant，NTP）、每穗粒數(shù)（grain number per panicle，GNPP）、結(jié)實率（seed setting rate，SR）、千粒重（1000-grain weight，GW）、單株產(chǎn)量（grain yield per plant，YD）等表型性狀進行鑒定。由于MAGIC群體有些株系沒穩(wěn)定有分離，有些株系在長沙不能正常抽穗，未能收集到所有株系表型數(shù)據(jù)，只收集到234份（MAGIC群體226份和8個親本）材料表型數(shù)據(jù)。

1.2 SNP基因型分析

Bandillo等[5-7]通過GBS測序技術(shù)對8個親本和MAGIC-Hei群體395個株系進行基因型分型。待種子萌發(fā)后，取新鮮葉片，按CTAB法提取DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對DNA的純度和核酸濃度進行檢測。用限制性內(nèi)切酶ApeKⅠ對基因組進行酶切，采用Illumina Hiseq測序平臺進行雙末端(Paired-end，PE)測序，測序完成后參照日本晴基因組篩選SNP標記。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2019整理表型數(shù)據(jù)，以2個重復(fù)的平均值作為相應(yīng)性狀的后續(xù)分析表型值，并計算 MAGIC-Hei群體的平均值、標準差、變幅、變異系數(shù)。利用DPS 14.10對抽穗期和產(chǎn)量性狀的相關(guān)性進行分析，兩年間表型的差異顯著性分析采用t檢驗。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

利用基于R語言的GAPIT包中的MLM（Mixed linear model）模型，以主成分分析（PCA）和親緣關(guān)系（K）作為協(xié)變量，結(jié)合SNP基因型數(shù)據(jù)，對MAGIC-Hei群體的抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀進行關(guān)聯(lián)分析。當P≤0.00001（-lgP=5）時，認為該標記與性狀顯著關(guān)聯(lián)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的可視化通過 R 3.2.2的 CMplot軟件包繪制曼哈頓圖（Manhattan Plot）和Q-Q圖（Quantile-quantile plot）來實現(xiàn)。用R2評價關(guān)聯(lián)位點對表型性狀的總體貢獻率[8]，QTL的命名參照McCouch等[9]提出的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和 MAGIC群體抽穗期及產(chǎn)量性狀的表現(xiàn)及相關(guān)性分析

分別對2017年和2018年兩個環(huán)境下的親本及群體的抽穗期及產(chǎn)量性狀進行統(tǒng)計。2017年8個親本抽穗期變幅為9～125 d，MAGIC-Hei群體的抽穗期為83～106 d，平均抽穗期為93.0 d；2018年8個親本抽穗期變幅為0～122 d，MAGIC-Hei群體的抽穗期為76～114 d，平均抽穗期100.0 d。兩年結(jié)果表明抽穗期在不同株系間差異明顯（表 1）。在2017年 8個親本單株有效穗數(shù)變幅為 12～21，MAGIC-Hei群體的單株有效穗數(shù)變幅為 10～27，平均單株有效穗數(shù)為17.25；2018年8個親本單株有效穗數(shù)變幅 11～18，MAGIC-Hei群體的單株有效穗數(shù)變幅為7～22，平均單株有效穗數(shù)為13.68。2017年 8個親本單株產(chǎn)量變幅 24.07～46.49 g，MAGIC-Hei群體的單株產(chǎn)量變幅為 11.56～62.96 g，平均單株產(chǎn)量為34.92 g；2018年8個親本單株產(chǎn)量變幅為23.52～37.77 g，MAGIC-Hei群體的單株產(chǎn)量變幅為1.14～67.73 g，平均單株產(chǎn)量為27.81 g。產(chǎn)量性狀結(jié)果表明，MAGIC-Hei群體的所有性狀均分離明顯，呈連續(xù)分布，說明水稻產(chǎn)量性狀屬于典型的數(shù)量性狀遺傳。

表1 親本和MAGIC群體在不同環(huán)境下抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀的表現(xiàn)及變異系數(shù)Table 1. Performance of parents and MAGIC populations for heading date and yield related traits.

表2 MAGIC群體抽穗期和產(chǎn)量性狀間的相關(guān)性分析Table 2. Correlation analysis on heading date and yield traits in MAGIC population.

表3 全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測到與抽穗期顯著關(guān)聯(lián)的位點Table 3. Loci significantly associated with heading date detected by genome-wide association analysis.

方差分析表明，每穗粒數(shù)、結(jié)實率年度間無顯著差異，但2017年抽穗期極顯著短于2018年，單株有效穗數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量則極顯著高于2018年。

性狀間的相關(guān)分析結(jié)果表明(表 2)，每穗粒數(shù)與單株有效穗數(shù)、千粒重呈極顯著負相關(guān)，每穗粒數(shù)與單株有效穗數(shù)兩年相關(guān)系數(shù)分別為-0.34和-0.25，每穗粒數(shù)與千粒重兩年相關(guān)系數(shù)分別為-0.30和-0.27。

2.2 抽穗期及產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

在2017和2018兩個環(huán)境下共計檢測到控制抽穗期的 QTL 6個，分別位于第 2、3、6、7、8和12染色體上，對表型的貢獻率變幅為 3.63%～9.21%(表 3)。其中，4 個 QTL(qHD3、qHD6、qHD7、qHD8)在兩年中均被檢測到，對表型貢獻率最高的是qHD8，在2017年環(huán)境下解釋9.21%的表型貢獻率。對表型貢獻率最小的是qHD3，2018年的貢獻率為4.29%。

在2017和2018環(huán)境下共計檢測到控制產(chǎn)量性狀的QTL 20個，包括控制單株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和單株產(chǎn)量的位點分別為3、4、3、5和5個，單個QTL對表型的貢獻率范圍5.13%～10.68%。在兩年間共定位的QTL有4個(qNTP9、qGNPP3、qSR8和qGW3)，分別控制單株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重，對表型的平均貢獻率分別為5.80%、8.59%、10.29%和7.07%(表4)。

2.3 優(yōu)良株系的篩選

根據(jù)抽穗期和產(chǎn)量性狀表型數(shù)據(jù)，結(jié)合SNP基因型篩選到5個攜帶較多有利等位基因的優(yōu)良株系，分別是 GID4170482、GID4172993、GID4173982、GID4173992和GID4171060（表5）。其中，雙基因聚合優(yōu)異株系 GID4170482，兩年單株有效穗數(shù)分別為27和22，兩年的抽穗期分別為87和92 d，攜帶有控制單株有效穗數(shù)的qNTP9，該位點前后SNP基因型為 TGCGC，同時攜帶控制抽穗期的qHD6，該位點前后 SNP基因型為 TGCCC。材料GID4172993兩年每穗粒數(shù)的平均值為237，兩年抽穗期平均值為91 d。材料GID4173982兩年的結(jié)實率均達到81.27%以上，材料GID4173992兩年的千粒重均達到26.88 g以上，材料GID4171060兩年單株產(chǎn)量的平均值為57.32 g。這些優(yōu)良株系可用于水稻高產(chǎn)育種。

表4 全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測到與產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點Table 4. Loci significantly associated with the yield traits detected by genome-wide association analysis.

表5 雙基因（抽穗期和產(chǎn)量因子）聚合的優(yōu)異株系Table 5. Excellent lines with two genes (heading date and yield factors) polymerization.

3 討論

水稻是我國的第一大糧食作物，高產(chǎn)始終是水稻育種進程的最重要目標之一。水稻抽穗開花期遇極端高溫天氣不僅影響水稻產(chǎn)量，同時會降低稻米品質(zhì)[10]，適宜的抽穗期可使植株在特定的生態(tài)條件下最大程度地利用當?shù)氐墓鉄豳Y源，也可使水稻開花灌漿期避開極端高溫天氣，降低高溫天氣對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。因此，亟需發(fā)掘新的水稻抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)位點，為水稻高產(chǎn)育種利用。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，抽穗期與結(jié)實率、單株產(chǎn)量呈極顯著負相關(guān)，推測這可能是因為部分材料在抽穗開花期遇高溫天氣。材料 GID4173666、GID4174244、GID4171059等在始穗期至齊穗期，遭遇高溫天氣（2018年8月7日-8月14日，日最高溫 36.5℃～38.1℃），導致結(jié)實率和單株產(chǎn)量明顯下降；GID4173365、GID4171060、GID4171107等材料兩年在抽穗揚花期均遇上了高溫，但結(jié)實率都高。由此推測本研究兩年重復(fù)定位到的某些水稻抽穗期和產(chǎn)量性狀相關(guān)基因很可能也是溫度鈍感相關(guān)基因。

本研究在兩年環(huán)境下分別檢測到6個和20個與抽穗期和水稻產(chǎn)量相關(guān)的QTL，兩年均被檢測到的QTL有8個。對于抽穗期，兩年均定位到4個QTL（qHD3、qHD6、qHD7、qHD8）分別覆蓋已克隆基因 OscpSRP43、HGW、GHD7.1、DTH8[11-14]。Raghavan等[5]對AGIC-Hei群體關(guān)于抽穗期做了關(guān)聯(lián)分析，檢測到8個與水稻抽穗期顯著關(guān)聯(lián)的QTL，分布于第 1、3、4、5、6、7和 8染色體上，其中定位于第3和8染色體的QTL與本研究結(jié)果一致，在本研究中連續(xù)兩年均被檢測到，而其他 QTL與本研究結(jié)果沒有重疊，可能是由于受不同生態(tài)區(qū)域光周期、溫度等環(huán)境因素影響。

與前人結(jié)果比較，關(guān)于水稻產(chǎn)量性狀，我們發(fā)現(xiàn) 11個定位區(qū)間內(nèi)或附近已有克隆的基因。qGNPP1.1、qGNPP4、qGNPP4、qGW1 在 2017 年被檢測到的，區(qū)間內(nèi)包含已克隆基因 OsSCAR1、OsMKKK10、OsGPX1、CAP1、OsDof2 和OsSar1c[15-20]。qNTP2、qYD1.1、qGW5 和 qGW8 在2018年被檢測到，覆蓋已克隆基因 OsGRF10、OsDET1、OsLIR1、JMJ703、OsOTUB1、OsSPL16[21-26]。其中，qGNPP3、qSR8、qGW3在兩年中能同時被檢測到，分別覆蓋已克隆QTL/基因RGB1、SPL29、GS3[27-29]。RGB1是ABA響應(yīng)和干旱適應(yīng)性的一個正調(diào)控因子，位于第3染色體，RGB1敲除植株表現(xiàn)出不育籽粒數(shù)目增多、植株矮化、籽粒變小、結(jié)實率和單株產(chǎn)量降低[27]。SPL29編碼尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UAP1)，spl29突變體的株高、穗長、總粒數(shù)、灌漿率、結(jié)實率以及千粒重均顯著降低[28]。GS3位于水稻第3染色體近著絲粒區(qū)，在調(diào)節(jié)籽粒和器官大小中發(fā)揮負調(diào)節(jié)子的功能，是控制水稻粒重和粒長的主效QTL，同時也是控制水稻粒寬和籽粒充實度的微效QTL[29]。本研究兩年均檢測到的 QTL相對較少，究其原因，可能是控制抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀的 QTL易受環(huán)境的影響，

導致兩年檢測到的QTL數(shù)量不同。

除上述已有克隆基因的區(qū)間外，本研究定位結(jié)果中還有多個與水稻抽穗期和產(chǎn)量性狀相關(guān)的新位點，分別是與水稻抽穗期顯著關(guān)聯(lián)的 2個QTL(qHD2、qHD12)，與水稻產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)的QTL（qNTP7、qNTP9、qGNPP1.2、qSR9、qGW7、qYD1.2、qYD7、qYD11、qYD12）。其中，與單穗粒數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的位點qNTP9，被定位于第9染色體的12-14 Mb區(qū)間內(nèi)，在兩年均被檢測到，說明該位點受環(huán)境影響較小，可用于進一步的精細定位和基因克隆。

本研究采用一個8親本的MAGIC群體，基于GBS測序的方法，對抽穗期和產(chǎn)量相關(guān)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘到一批關(guān)聯(lián)顯著標記和農(nóng)藝性狀優(yōu)良且含有優(yōu)異等位基因的優(yōu)異種質(zhì)，為MAS育種方法加速水稻高產(chǎn)育種進程提供了基因資源。

謝辭: 感謝國際水稻研究所葉國友博士提供MAGIC群體及其基因型，感謝本實驗室金建楚和趙文錦協(xié)助抽穗期的調(diào)查。