李宇恒，鄧誠思，關(guān)愛偉，宋曉宇，馮艷玲，關(guān)奕，曹流

（中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，沈陽 110122）

張力蛋白同源的第 10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通過調(diào)控過磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，Pl3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的平衡，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞遷移等信號(hào)通路，發(fā)揮其抑癌功能［1］。PTEN表達(dá)的缺失可見于多種腫瘤，可能與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)［2］。

常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9，CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是一種在小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）的指導(dǎo)下在基因組水平上對目的基因DNA序列進(jìn)行改造的定點(diǎn)編輯技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)目的基因的完全敲除。自目標(biāo)設(shè)計(jì)始，基因修飾可在1～2周內(nèi)完成，修飾的克隆細(xì)胞株可在2～3周內(nèi)獲得［3］。CRISPR/Cas9因其高效率和高精度得到了廣泛的關(guān)注。本研究擬利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立PTEN基因靶向敲除細(xì)胞株，探討PTEN對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清（中國Clark公司）、1%青霉素和鏈霉素（中國GENVIEW公司）的DMEM培養(yǎng)基（德國BI公司），在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞株KLE（美國ATCC公司），細(xì)胞呈貼壁生長。

1.1.2 主要試劑：DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司），BBSⅠ酶（美國Sigma公司），T4 DNA連接酶（美國Sigma公司），DH5α感受態(tài)E.coli（日本TaKaRa公司），PrimeSTAR GXL DNA Polymeres PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Promega DNA純化試劑盒（美國CST公司），質(zhì)粒提取試劑盒（中國TIANGEN公司），Biobest轉(zhuǎn)染試劑（美國CST公司），PTEN、LC3、P62抗體（美國CST公司），CCK-8（美國Bimake公司）。

1.2 puro-cas9-PTEN-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//tools.genome-engineering.org），對PTEN基因1個(gè)外顯子序列進(jìn)行分析，篩選出評分較高的sgRNA序列（靶點(diǎn)序列sgRNA1，5’-caccgTTGAGAGTTGAG CCGCTGTG-3’；sgRNA2，5’-caccgTCATGGCTGCAG CTTCCGAG-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 sgRNA的磷酸化與退火：磷酸化體系包含100 μmol/L Oligo-gRNA-F 1 μL，100 μmol/L Oligo-gRNA-R 1 μL，10×kinase buffer A 1 μL，100 mmol/L ATP 0.5 μL，T4 PNK 0.5 μL，ddH2O 6 μL，共10 μL體系，置于37 ℃30 min。退火條件95 ℃5 min，75 ℃5 min，55℃5 min，35 ℃5 min。獲得雙鏈gRNA。

1.2.3 sgRNA載體構(gòu)建：將雙鏈gRNA與BBSⅠ酶切純化后的載體混合（質(zhì)量比1 ∶3）連接。T4 DNA連接酶 16 ℃連接 16 h。取連接產(chǎn)物，DH5α感受態(tài)E.coli轉(zhuǎn)化，用氨芐抗性篩選陽性克隆，挑取單克隆后搖菌，取菌液送生工生物測序，確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.3 構(gòu)建PTEN穩(wěn)定敲除的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株

1.3.1 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE的轉(zhuǎn)染以及加藥篩選：接種KLE細(xì)胞至6 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，按照說明書用Biobest轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染puro-cas9-PTEN-sgRNA1和puro-cas9-PTEN-sgRNA2。4～6 h后換為10%細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，72 h后傳代并將培液換成帶有嘌呤霉素（1 μg/mL）的10%DMEM 培養(yǎng)基篩選，5 d后，細(xì)胞稀釋接種于96孔板中，篩選單克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2PTEN穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的鑒定：（1）根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫PTEN基因組的序列以及sgRNA切點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)引物（F，CTGGAGCGG GGGGGAGAAGC；R，TCAGACTTTTGTAATTTGTG），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。（2）提取單克隆細(xì)胞株的DNA，以DNA為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系包括DNA 200 ng，5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，Primer-F（10 μmol/L）1 μL，Primer-R（10 μmol/L）1 μL，PrimeSTAR GXL DNA polymeres 0.5 μL，加ddH2O至50 μL 。PCR反應(yīng)條件如下，98 ℃ 5min；98 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃10 min。（3）通過酚氯仿-異戊醇/乙醇沉淀方法純化獲得的目的基因，取40 μL PCR產(chǎn)物，加入160 μL 1×TE buffer（pH8.0）混勻后，加入酚氯仿-異戊醇 200 μL，劇烈震蕩，離心（14 000 r/min）20 min，取上清，加入20 μL 3 mol/L醋酸鈉、400 μL無水乙醇混勻后，離心（14 000 r/min）15 min，棄上清，加500 μL 70%乙醇混勻，離心（14 000 r/min）15 min，棄上清，加18 μL ddH2O溶解純化產(chǎn)物。（4）取純化產(chǎn)物加2 μL NEB2 buffer退火（75 ℃5min，55 ℃5 min，35 ℃5 min，20 ℃5 min），退火產(chǎn)物加0.5 μL T7E1，于37 ℃酶切1 h，用2%瓊脂糖凝膠電泳分離觀察酶切情況。

1.4 Western blotting

將經(jīng)篩選獲得的細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集對照野生型子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞和PTEN敲除的KO細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 蛋白試劑盒定量。行SDS-PAGE 電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h，4 ℃搖床孵育PTEN、tubulin、P62、LC3 抗體過夜，PBST 緩沖液洗膜 3 次（10 min/次），二抗室溫孵育 1 h，PBST 緩沖液洗膜 3次（10 min/次），顯影檢測。

1.5 CCK-8細(xì)胞活性檢測

于48孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞懸液（50 000/孔），培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 sgRNA設(shè)計(jì)結(jié)果

在NCBI數(shù)據(jù)庫獲取人源PTEN的cDNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇目標(biāo)外顯子，通過網(wǎng)站（http：//tools.genome-engineering.org）設(shè)計(jì)并預(yù)測sgRNA效率，并初步選擇出得分最高的sgRNA。見圖1。

圖1 PTEN基因sgRNA設(shè)計(jì)示意Fig.1 Design of PTEN gene sgRNA

2.2 T7E1酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果

T7E1酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對KLE細(xì)胞基因組中的PTEN切割成功。見圖2。

圖2 T7E1酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of T7E1 enzyme digestion

2.3 等位基因敲除后蛋白表達(dá)情況

Western blotting結(jié)果顯示，進(jìn)行基因敲除的細(xì)胞系PTEN蛋白表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步證明了基因敲除成功。見圖3。

2.4 自噬相關(guān)因子LC3、P62蛋白的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，PTEN敲除后，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)因子P62的表達(dá)增加，LC3Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化減少，提示細(xì)胞自噬受到抑制。見圖3。

圖3 PTEN敲除后細(xì)胞內(nèi)PTEN和自噬相關(guān)因子檢測Fig.3 Detection of intracellular PTEN and autophagy related factors after PTEN knockout

2.5 CCK-8細(xì)胞活性檢測

CCK-8細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示，PTEN敲除的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞活性高于對照組野生型子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，PTEN敲除的細(xì)胞增殖明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8細(xì)胞活性檢測結(jié)果Fig.4 Results of CCK-8

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了PTEN敲除的人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞模型。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)作為第三代基因編輯技術(shù)，促進(jìn)基因組中特定位點(diǎn)的靶向DNA發(fā)生雙鏈斷裂后，通過非同源性末端接合或同源介導(dǎo)修復(fù)方式刺激基因組重新編輯，實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因、位點(diǎn)的特異性突變，從而使特定基因完全喪失生物學(xué)功能［4-5］。與鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)相比，CRISPR/Cas9的優(yōu)勢在于易操作、效率高、周期短、工作量小、成本低［6-9］。但CRISPR/Cas9 技術(shù)也存在一定限制，即Cas9通過sgRNA上的20-nt引導(dǎo)序列定位于特定的基因組位點(diǎn)，在靶標(biāo)上具有作用范圍，同時(shí)也具有潛在的脫靶突變［10-11］。本研究設(shè)計(jì)并選取了多個(gè)sgRNA序列，經(jīng)過驗(yàn)證最終確定了最佳sgRNA序列。此外，由于CRISPR/Cas9 質(zhì)粒需要表達(dá)的 Cas9 蛋白較其他載體大，且具有一定的細(xì)胞毒性［12］，對轉(zhuǎn)染及后續(xù)的篩選和單克隆培養(yǎng)造成了一定的困難，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期長于預(yù)期。

PTEN是人類癌癥中最常見的突變抑癌基因之一，在乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種人類癌癥中均可見突變［13］。細(xì)胞自噬是一種重要的細(xì)胞學(xué)功能，在正常的生理過程中起著“管家”的作用，細(xì)胞通過自噬行為清除受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，從而參與生長和衰老的調(diào)控。自噬調(diào)節(jié)的缺陷在許多疾病中起重要作用，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、病原體感染和代謝性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，在人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中敲除PTEN明顯抑制了細(xì)胞自噬，并介導(dǎo)了人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖加快。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN的敲除使子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞自噬受到抑制，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖加快。因此，探討PTEN缺失導(dǎo)致的細(xì)胞自噬異常，對于子宮內(nèi)膜癌的研究與治療具有重要的意義。