王一喆 ，金悅，王曉楠，包博文，程陽，車曉芳，胡雪君

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1.老年呼吸感染科；2.腫瘤內科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

惡性腫瘤已經成為僅次于心腦血管疾病的全球第二大死因，每年因惡性腫瘤死亡人數(shù)接近九千萬，十年間腫瘤死亡人數(shù)增加了17.8%［1］。我國國家癌癥中心最新發(fā)布的資料［2］顯示居民因惡性腫瘤死亡人數(shù)占全部死亡的23.91%，且近十年來惡性腫瘤的死亡率持續(xù)上升，成為嚴重威脅我國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。肺癌位居我國惡性腫瘤致死原因首位，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已為晚期，錯過了最佳的治療時機。因此，尋找能夠指導肺癌診斷和治療的特異性生物標志物，特別是與肺癌患者總生存期相關的潛在靶點是肺癌治療領域亟待解決的問題。

有氧糖酵解（Warburg效應）是腫瘤最主要的代謝改變之一［3］。最初認為糖酵解的主要作用是為腫瘤細胞提供能量來源，但越來越多研究［4-6］證實，與正常細胞相比，腫瘤產能模式發(fā)生改變，糖酵解的關鍵酶亦可作為信號分子參與調節(jié)重要的腫瘤相關信號通路，改變腫瘤細胞的增殖和侵襲能力［7］?，F(xiàn)已明確作為診斷或治療靶點的糖酵解相關酶包括葡萄糖轉運體1（glucose transporter 1，GLUT1）［8］、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）［9］和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）［10］等。果糖二磷酸醛縮酶A（fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA）也是糖酵解中關鍵的限速酶之一，負責催化果糖-1，6-二磷酸酯可逆性轉化為甘油醛-3-磷酸和磷酸二羥丙酮。既往研究表明，ALDOA在結腸癌［11］和胰腺癌［12］中高表達且與不良預后相關，但在骨肉瘤中ALDOA的表達與患者總生存期呈負相關［13］，提示ALDOA雖然與腫瘤發(fā)展密切相關，但在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。因此ALDOA對腫瘤的影響還需在更多的癌種中進行更深入研究?，F(xiàn)有研究［14］顯示，外源性補充大劑量ALDOA可以使肺癌細胞的增殖和遷移能力增加，提示ALDOA可能促進腫瘤的生長和轉移。然而，關于ALDOA的表達是否影響肺癌預后、是否可以作為預后預測的生物標志物等問題尚無結論。

本研究通過癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)集和Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫的大樣本研究，探討ALDOA在肺癌中的表達與臨床病理學參數(shù)和預后的相關性，預測ALDOA可能參與調控的腫瘤相關生物通路，為ALDOA成為肺癌的生物標志物和治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來源和數(shù)據(jù)整理

本研究數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//tega-data.nci.nih.gov/tcg/）中截止至2016年1月28日的肺癌樣本信息，即名稱為“TCGA-LUAD”的肺腺癌組織樣本數(shù)據(jù)和名稱為“TCGA-LUSC”的肺鱗癌組織樣本數(shù)據(jù)，包括臨床相關病理學參數(shù)和腫瘤組織樣本的轉錄組測序結果（RNAseqGene）。根據(jù)臨床樣本信息的數(shù)據(jù)完整性以及與測序樣本的匹配程度進行篩選，共329例（114例肺腺癌樣本和215例肺鱗癌樣本）納入本研究。以所有肺癌患者的ALDOA表達中位值為臨界值，分為ALDOA高表達組和ALDOA低表達組。利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung）的肺癌數(shù)據(jù)集驗證ALDOA（200966_x_at）對不同病理類型肺癌患者生存的影響。

1.2 方法

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），以所有肺癌患者的ALDOA表達中位值為臨界值，將RNAseqGene數(shù)據(jù)中肺腺癌腫瘤組織樣本分為ALDOA高表達組和ALDOA低表達組。從MsigDB數(shù)據(jù)庫中下載腫瘤研究中常用的h.all.v6.2.symbols.gmt基因集作為參照基因集。采用GSEA 3.0版本預測ALDOA的表達水平在肺腺癌中參與的通路。GSEA軟件設置按照默認參數(shù)，隨機組合次數(shù)為1 000次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析和作圖。采用χ2檢驗進行組間比較，生存分析采用Kaplan-Meier計算生存率，log-rank檢驗法進行統(tǒng)計學檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GSEA中，為篩選出最有可能產生有意義的科學假設，減少假陽性風險，F(xiàn)DR＜ 0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結果

2.1 ALDOA基因的表達水平與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關系

本研究共納入肺癌患者329例，女126例，男203例；年齡38～86歲，年齡中位數(shù)68歲。T分期，T1期82例，T2期197例，T3期33例，T4期17例；N分期，N0期210例，N1期75例，N2期38例，N3期6例；M分期，M0期319例，M1期10例。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌樣本的臨床預后數(shù)據(jù)，高表達組165例，低表達組164例。ALDOA與臨床病理學參數(shù)相關性的結果顯示，ALDOA的表達水平與病理分型顯著相關（P=0.010），肺腺癌中ALDOA低表達比例明顯高于肺鱗癌；然而，ALDOA表達與性別、年齡、T分期、N分期、M分期無顯著相關性（均P＞ 0.05），見表1。這些結果提示ALDOA表達在不同肺癌亞型之間差異顯著，它對肺腺癌和肺鱗癌預后的影響及與2種亞型臨床病理學參數(shù)的關系可能不同。

2.2 ALDOA的表達與肺癌患者預后的相關性

利用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗探討ALDOA表達對肺癌患者總生存的影響，結果如圖1所示，ALODA高表達肺癌患者的總生存期明顯短于低表達患者（圖1A，P=0.001）。由于ALDOA表達在肺腺癌和肺鱗癌2種亞型中具有統(tǒng)計學差異，因此又進一步在各亞型（肺腺癌和肺鱗癌）患者中分析了ALDOA表達與預后的關系。結果顯示，ALDOA高表達的肺腺癌患者生存期明顯縮短（圖1B，P=0.001），而ALDOA表達對肺鱗癌患者預后無明顯影響（圖1C，P=0.135）。這些結果提示ALDOA高表達的肺癌患者（尤其是肺腺癌患者）預后差，對肺癌整體患者預后的影響可能主要來自肺腺癌患者。利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫中擴大樣本量進行驗證，其結論與TCGA數(shù)據(jù)一致（圖2，肺癌P=9.4e-12，肺腺癌P=4.5e-11，肺鱗癌P=0.307 2）。以上結果均提示ALDOA高表達是肺癌、特別是肺腺癌的預后不良因素。

表1 ALDOA表達水平與329例肺癌患者臨床指標的相關性［n（%）］Tab.1 Correlation between ALDOA expression and clinical parameters of 329 lung cancer patients［n（%）］

2.3 不同肺癌亞型中ALDOA表達與臨床病理參數(shù)的關系

在肺腺癌和肺鱗癌兩種亞型中，分別采用χ2檢驗分析ALDOA與各臨床病理學參數(shù)的相關性。結果如表2所示，ALDOA表達水平與114例肺腺癌的T分期（P=0.026）和N分期（淋巴結轉移數(shù)目，P=0.026）具有顯著相關性，而與性別（P=0.543）、年齡（P=0.703）以及遠處轉移（P=0.177）無顯著相關。在T分期中，ALDOA高表達在T3～T4期中的比例更高，提示ALDOA與肺腺癌的浸潤深度呈正相關。在N分期中，ALODA高表達在發(fā)生淋巴結轉移組中比例更高。然而，在215例肺鱗癌患者中ALDOA的表達水平與各臨床病理學參數(shù)均無關（表3）。這些結果提示，ALDOA可能促進肺腺癌的增殖和轉移；在肺腺癌中ALDOA可作為患者預后預測的生物標志物，來指導診斷和治療。

2.4 ALDOA在肺腺癌中的相關功能基因富集分析

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中ALDOA表達的生存分析Fig.1 Survival analysis of ALDOA expression in TCGA database

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中ALDOA表達的生存分析Fig.2 Survival analysis of ALDOA expression in Kaplan-Meier Plotter database

表2 ALDOA表達水平與114例肺腺癌患者臨床指標的相關性［n （%）］Tab.2 Correlation between ALDOA expression and clinical parameters of 114 lung adenocarcinoma patients［n （%）］

為進一步為深入了解ALDOA如何促進肺腺癌的增殖和轉移，利用GSEA分析探討ALDOA可能的相關信號通路，并在富集結果中選擇FDR＜0.25的基因集作為顯著富集基因集以減少多重假設導致的假陽性結果。結果顯示，在ALDOA高表達的肺腺癌患者樣本中共富集出39條通路，取顯著富集通路中校正后富集分數(shù)（normalized enrichment score，NES）前20的相關通路進行展示（圖3A）。其中，ALDOA除與糖酵解（圖3B）等代謝相關通路密切相關外，還與上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT，圖3C）、G2M檢查點（圖3D）、凋亡（圖3E）等腫瘤增殖及轉移通路相關。這些結果提示ALDOA可能通過調節(jié)糖代謝以及細胞周期、凋亡、EMT等通路共同促進了肺癌的增殖及轉移。

3 討論

通過在線數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織ALDOA高表達的肺癌患者（尤其是肺腺癌患者）預后更差，并且ALDOA高表達的患者更趨于晚期的腫瘤浸潤深度和更多的淋巴結轉移數(shù)目。既往研究提示，ALDOA在胃癌［15］、肝癌、胰腺癌［16］等多種腫瘤中高表達，不僅可作為腫瘤患者預后標志物［11］，還可作為腫瘤獲得高轉移能力［12］、產生藥物抵抗［17］的預測指標。在肺癌中，馮小鵬等［18］通過比較肺癌患者和非肺癌患者胸腔積液中ALDOA的表達，發(fā)現(xiàn)ALDOA的表達在惡性胸水中更高，且腺癌組明顯高于鱗癌組和小細胞肺癌組。本結果進一步補充了ALDOA在肺癌腫瘤組織中的表達與患者預后的關系。其中，在腺癌中ALDOA的表達與患者的不良預后顯著相關（P=0.001），且ALDOA高表達的患者更容易發(fā)生淋巴結轉移，而在鱗癌中并無此種相關性。這些結果提示在腺癌中ALDOA更可能參與腫瘤細胞的轉移，從而影響預后。然而，根據(jù)DU等［19］報道，與肺鱗癌患者的癌旁組織比較，ALDOA在肺鱗癌腫瘤組織中明顯高表達，且與更多的淋巴結轉移數(shù)目和不良預后相關，這與既往研究和本結果有差異。究其原因認為：（1）該研究并未提及ALDOA在肺腺癌中的作用，無法根據(jù)同樣的實驗條件比較和判斷在何種病理類型中ALDOA起到的作用更顯著；（2）該研究中的樣本較小，并且僅為肺鱗癌患者樣本；（3）本研究數(shù)據(jù)基于轉錄組測序結果進行分析，而該研究中僅檢測了患者組織中的蛋白表達水平，其RNA水平與患者預后的相關性未知。因此，在進一步的研究中尚需擴大樣本量，且從多個維度確認ALODA與肺癌患者病理學參數(shù)及預后的關系。

圖3 ALDOA高表達患者腫瘤組織中顯著富集通路Fig.3 Enriched pathways in tumor tissues of patients with high ALDOA expression

腫瘤細胞發(fā)生轉移，首先需要發(fā)生遠處器官的物理易位，然而更重要的是，癌細胞在遠端部位發(fā)展成轉移性病變的能力［20］。腫瘤代謝的重編程為腫瘤細胞爭取到了在新環(huán)境生存的有利條件。高度惡性或者發(fā)生轉移的腫瘤細胞中糖酵解能力更強，提示了腫瘤代謝條件的改變與其增殖和侵襲遷移的能力存在潛在相關性。增加ALDOA的表達可加快腫瘤細胞糖酵解的過程，降低ALDOA的表達使ATP產生減少，降低細胞膜完整性［21］。除了調控糖酵解和能量代謝，ALODA也可以通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在低氧環(huán)境下，ALDOA可以通過調節(jié)低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）介導腫瘤細胞發(fā)生EMT，從而增強了腫瘤細胞的遷移能力［12，22］。在肺癌中，ALDOA過表達促進乳酸釋放，阻斷脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）活性，并進一步增加HIF-1α穩(wěn)定性［23］，同時促進HIF-1α的下游靶標基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）顯著上調；應用MMP-9抑制劑可以抑制ALDOA過表達上調的肺癌細胞遷移能力。本研究GSEA結果也富集到EMT通路呈正相關，與以往研究結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)在該通路中主要包括層黏連蛋白2（laminin subunit gamma 2，LAMC2）、轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、整合素（integrin subunit alpha，ITGA）5、ITGA2、ITGB1等分子，因此推測ALDOA可能通過這些分子誘導肺腺癌細胞發(fā)生EMT，從而獲得遷移能力。另外，利用GSEA在ALDOA高表達患者中富集出ALDOA與RAS蛋白激活劑樣2（RAS protein activator Like 2，RASAL2）、DNA聚合酶α2（DNA polymerase alpha 2，POLA2）、細胞分裂周期20（cell division cycle 20，CDC20）等細胞增殖相關分子，及凋亡抑制因子（baculoviral IAP repeat containing 3，BIRC3）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4、GPX1、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）等抗凋亡相關因子密切相關，提示ALDOA可能通過這些分子調控細胞周期和凋亡，從而促進腫瘤細胞快速增殖。因此擬在今后的研究中利用肺癌細胞模型及動物模型驗證本研究的分析結果，以明確ALDOA促進肺腺癌增殖和轉移的確切機制。

綜上所述，本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫及Kaplan-Meier-Plotter在線數(shù)據(jù)庫中的結果進行分析，明確了ALDOA對肺癌（尤其是肺腺癌）患者預后的指導意義，并通過GSEA推測ALDOA可能通過參與調控糖酵解、細胞周期、細胞凋亡等相關通路促進腫瘤的生長和遷移。深入了解ALDOA在肺癌中發(fā)揮的重要機制可為轉移性肺癌治療提供新的治療靶點。