邸 松,鐘方麗,王曉林,王 璐,高 園

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林吉林 132022)

雙刺參膠囊是由刺玫果、刺五加及人參三味中藥材經(jīng)過(guò)適當(dāng)工藝加工而成的保健食品,其擬申報(bào)的保健功能為緩解體力疲勞。蘇聯(lián)學(xué)者N·布赫曼以“第三狀態(tài)”描述了其所發(fā)現(xiàn)的非健康非疾病的狀態(tài),即亞健康狀態(tài)[1]。疲勞是亞健康人群一種常見(jiàn)的狀態(tài)[2],長(zhǎng)期處于該狀態(tài)下的人群,其免疫系統(tǒng)存在明顯異常甚至受損[3]。

保健食品是一種適用于特定人群使用,具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能,不以治療疾病為目的食品[4]。中藥類保健食品,是在中醫(yī)“藥食同源”基礎(chǔ)上[5],以中藥為主要成分的具有保健養(yǎng)生功能的特殊食品[6]。刺玫果含有豐富的黃酮及皂苷類成分,具有抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、保肝、促智等藥理作用[7]。刺五加主要含有三萜、木脂素、皂苷類成分等,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、緩解體力疲勞、保護(hù)神經(jīng)中樞系統(tǒng)等藥理活性[8]。人參皂苷是人參的主要活性成分,具有抗衰老、抗抑郁等多種保健功效[9]。在國(guó)家公布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中,人參、刺玫果及刺五加均屬于可用于保健食品的藥食同源類藥材[10]。大量文獻(xiàn)表明,三者提取物中的皂苷類成分均具有較強(qiáng)的抗疲勞功效[11-13],其中人參三醇型皂苷(人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)、二醇型皂苷(人參皂苷Rb1)[14]及紫丁香苷[15]為主要活性成分。梁少雄[16]和姜麗萍等[17]采用高效液相色譜法分別測(cè)定了參苓白術(shù)散和復(fù)方雙參顆粒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量;姚路路等[18]和奉艷花等[19]采用乙腈-水梯度洗脫,分別測(cè)定刺五加甘草顆粒和壯藥愈瘍散中紫丁香苷的含量。在工業(yè)生產(chǎn)中,質(zhì)量檢測(cè)儀器需長(zhǎng)時(shí)間工作,在檢測(cè)過(guò)程中流動(dòng)相流速、柱溫箱溫度、檢測(cè)器靈敏度會(huì)出現(xiàn)不同程度的波動(dòng),且隨著儀器使用時(shí)間加長(zhǎng),波動(dòng)將逐漸明顯,所以對(duì)于方法的耐用性要求較高。研究者大多只建立了檢測(cè)方法,未對(duì)方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究采用高效液相色譜法,在建立雙刺參膠囊中4種有效成分的含量測(cè)定方法的同時(shí),對(duì)檢測(cè)方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià),為雙刺參膠囊的進(jìn)一步研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙刺參膠囊 自制;人參、刺五加、刺玫果 中藥飲片,吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司;人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1純度>98.5%,成都曼思特生物科技有限公司;紫丁香苷 純度>99.5%,成都曼思特生物科技有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent-1260型高效液相色譜儀 配有DAD陣列檢測(cè)器,安捷倫科技有限公司;1201型高效液相色譜儀 配有UV檢測(cè)器,大連依利特分析儀器有限公司;FA2004N型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀有限公司;SK5210HP型超聲波清洗器(超聲功率:200 W,工作頻率:53 kHz) 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙刺參膠囊的制備 取人參粉、刺玫果粉、刺五加粉按處方量混合,加入5倍量90%乙醇,于80 ℃水浴提取2次,每次1 h。合并濾液,60 ℃減壓濃縮為稠膏,干燥,粉碎成細(xì)分,加入適量淀粉混合均勻,制粒、干燥,加入顆粒質(zhì)量1%的硬脂酸鎂,混勻,灌裝至1#膠囊中,既得雙刺參膠囊(每粒0.35 g)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 供試品溶液的制備 取10粒雙刺參膠囊內(nèi)容物,將內(nèi)容物混合研碎,精密稱取1.0 g,置于燒瓶中,加20 mL甲醇,超聲處理(功率200 W,頻率53 kHz)30 min,放冷后過(guò)濾,濾渣經(jīng)甲醇洗滌,將濾液及洗滌液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,定容至刻度,即得。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1、Re、Rb1各約10 mg,精密稱定,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容。分別吸取上述溶液各3.0 mL,置于10 mL容量瓶中,混合,定容,即得質(zhì)量濃度分別為0.369、0.306、0.339 mg/mL的人參皂苷Rg1、Re、Rb1的混合對(duì)照品溶液。

稱取干燥至恒重的紫丁香苷對(duì)照品約2 mg,精密稱定,置于50 mL棕色容量瓶中,加入適量甲醇溶解,定容,即得質(zhì)量的濃度為0.046 mg/mL的紫丁香苷對(duì)照品溶液。

1.2.3 檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1色譜條件的選擇 人參皂苷因?yàn)榫哂休^多的藥、食功效[20],進(jìn)而有比較成熟的含量檢測(cè)方法,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)查閱[21-23],使用Nano-Micro UniSil 5-120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,分別考察乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫,根據(jù)目標(biāo)峰的分離度、保留時(shí)間、拖尾因子等因素優(yōu)選出適用于雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測(cè)定的色譜條件。

1.2.3.2 紫丁香苷色譜條件的選擇 柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm,分別使用依利特ODS2、BDS-C18及APS色譜柱,考察乙腈-水(10∶90)、乙腈-水(15∶85)等度洗脫及乙腈-水梯度洗脫,根據(jù)目標(biāo)峰的理論板數(shù)、保留時(shí)間、峰形等因素確定其色譜條件。

1.2.4 含量測(cè)定的方法學(xué)考察

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取人參皂苷混合對(duì)照品溶液、紫丁香苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中,定容,分別在對(duì)應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積,以各成分的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.4.2 檢測(cè)限及定量限的確定 吸取紫丁香苷及人參皂苷混合對(duì)照品溶液,加入甲醇按比例進(jìn)行稀釋。在色譜條件下進(jìn)樣,分別記錄各成分峰面積,當(dāng)信噪比為3和10時(shí),計(jì)算各成分對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度,即為各成分所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)限和定量限。

1.2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取人參皂苷混合對(duì)照品溶液及紫丁香苷對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL,在相應(yīng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各成分的峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次雙刺參膠囊,按照供試品溶液制備方法進(jìn)行溶液制備。按照色譜條件進(jìn)樣6次,分別記錄人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 吸取同一供試品溶液,分別在0、6、12、24、36、48 h進(jìn)樣,記錄目標(biāo)峰的峰面積,計(jì)算RSD值。

1.2.4.6 系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn) 在選定的流動(dòng)相條件下,通過(guò)測(cè)定條件(檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相流速及檢測(cè)溫度)及色譜柱的改變,對(duì)樣品再次進(jìn)行含量測(cè)定,以測(cè)定的含量為依據(jù),進(jìn)行耐用性考察。

1.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量的雙刺參膠囊內(nèi)容物6份,每份1.0 g,精密稱定,分別加入1.47 mg的人參皂苷Rg1、1.90 mg的人參皂苷Re及3.67 mg的人參皂苷Rb1,按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液,在人參皂苷檢測(cè)的色譜條件下進(jìn)樣,記錄各目標(biāo)峰的峰面積,計(jì)算回收率。

1.2.5.2 紫丁香苷的回收率實(shí)驗(yàn) 稱取適量已知紫丁香苷含量的雙刺參膠囊內(nèi)容物9份,每份1.0 g,精密稱定,每3份為一組,分別加入已知含量50%、100%及150%的紫丁香苷,按照供試品溶液制備方法進(jìn)行溶液制備,在色譜條件下進(jìn)樣,記錄紫丁香苷的峰面積,計(jì)算紫丁香苷回收率。

1.2.6 雙刺參膠囊中有效成分的含量測(cè)定 稱取雙刺參膠囊內(nèi)容物3份,每份1.0 g,精密稱定,按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別在對(duì)應(yīng)各成分的色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,數(shù)據(jù)處理采用安捷倫1260型高效液相脫機(jī)工作站,及Origin作圖整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品溶液制備方法的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了超聲次數(shù)對(duì)各成分轉(zhuǎn)移率的影響,取1.0 g樣品,加入甲醇超聲(功率200 W,頻率53 kHz)處理30 min,放冷至室溫,過(guò)濾,使用甲醇洗滌濾渣,合并濾液及洗液后定容為25 mL。剩余濾渣重復(fù)上述操作3次,得到4組供試品溶液,分別在色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)1次超聲處理,供試品中的4中皂苷類成分轉(zhuǎn)移至溶劑中的轉(zhuǎn)移率均大于96.5%,可視為完全轉(zhuǎn)移。故最終選擇超聲處理1次制備供試品溶液。

2.2 檢測(cè)方法的確定

當(dāng)人參皂苷的檢測(cè)選用流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫時(shí),人參皂苷Rg1及人參皂苷Re無(wú)法分離。在檢測(cè)紫丁香苷時(shí),選用依利特ODS2色譜柱時(shí)采用乙腈-水等度洗脫無(wú)目標(biāo)峰出現(xiàn),采用乙腈-水梯度洗脫時(shí)目標(biāo)峰拖尾嚴(yán)重;選用BDS-C18色譜柱時(shí),各組流動(dòng)相下目標(biāo)成分的分離度小于1.5;選用APS色譜柱,采用乙腈-水等度洗脫時(shí),紫丁香苷對(duì)應(yīng)峰分離度較低。最終確定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測(cè)定的色譜條件為:Nano-Micro UniSil 5-120 C18色譜柱,以乙腈-水為流動(dòng)相,按一定梯度洗脫,梯度洗脫程序見(jiàn)表2,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm,進(jìn)樣量10 μL,流速1.0 mL/min;紫丁香苷含量測(cè)定的色譜條件為:APS色譜柱,以乙腈-水作為流動(dòng)相梯度洗脫(表3),柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm進(jìn)樣量10 μL,流速1.0 mL/min。在對(duì)應(yīng)色譜條件下,各成分的保留時(shí)間、分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子見(jiàn)表4。對(duì)應(yīng)的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。高效液相色譜法測(cè)定相關(guān)成分含量時(shí),系統(tǒng)適應(yīng)性要求分離度應(yīng)大于1.5,主峰拖尾因子不得大于2.0,理論塔板數(shù)應(yīng)大于3000,從表4中可以看出,4種有效成分目標(biāo)峰的理論塔板數(shù)均大于20000,分離度均大于2.12,說(shuō)明色譜柱柱效較好,4種物質(zhì)目標(biāo)峰與相鄰峰完全分離。由4種物質(zhì)的拖尾因子可知,人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對(duì)稱性較好,人參皂苷Rb1和紫丁香苷略有拖尾現(xiàn)象。

表2 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、 人參皂苷Rb1的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure of ginsenoside Rg1,Re,Rb1

圖1 雙刺參膠囊的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectra of Shuangcishen capsules注:A:人參皂苷混合對(duì)照品色譜圖(波長(zhǎng):203 nm);B:紫丁香苷色譜圖(波長(zhǎng):265 nm);C:供試品溶液色譜圖(C1波長(zhǎng):203 nm;C2波長(zhǎng)265 nm);1:人參皂苷Rg1;2:人參皂苷Re;3:人參皂苷Rb1;4:紫丁香苷。

表3 紫丁香苷的梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure for syringin

表4 4種成分的色譜數(shù)據(jù)Table 4 Chromatogram data of four kinds of components

2.3 含量測(cè)定的方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4種有效成分均以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合方程、線性范圍、檢測(cè)限及定量限見(jiàn)表5。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別為15.30～306.00、16.95～339.00、18.45～369.00、4.60～46.00 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積值呈良好的線性關(guān)系,其檢測(cè)限分別為:0.77、0.89、0.93、0.12 μg/mL,其定量限分別為:2.21、2.71、2.74、0.38 μg/mL。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Standard curve drawing test result

2.3.2 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在上述色譜條件測(cè)定雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷,儀器精密度良好,方法重復(fù)性較好,供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定,滿足測(cè)定要求。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 6 Methodological investigation result(n=6)

2.3.3 系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在測(cè)定條件微小調(diào)整后對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定,相應(yīng)色譜條件下的樣品含量測(cè)定值對(duì)應(yīng)的RSD值均小于3%,表明測(cè)定方法耐用性良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7、表8。

表7 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 System durability test results of ginsenoside Rg1,Re,Rb1

表8 紫丁香苷系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 System durability test result for syringing

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表9、表10可知,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的平均加樣回收率分別為100.13%、100.50%、102.33%、101.55%,RSD值分別為0.67%、0.99%、0.29%、0.68%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度高,可用于雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、紫丁香苷的含量測(cè)定。

表1 供試品溶液制備方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Preparation method test results of test solution

表9 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 9 Test results of ginsenoside Rg1,Re,Rb1 loading recovery(n=6)

表10 紫丁香苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 10 Syringin recovery test results(n=9)

2.3.5 樣品中各有效成分含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3批雙刺參膠囊含量測(cè)定結(jié)果顯示,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量分別為137.90、189.58、356.83 mg/100 g(相當(dāng)于每粒含0.48、0.66、1.25 mg),紫丁香苷為114.99 mg/100 g(相當(dāng)于每粒含0.40 mg),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙刺參膠囊中含有抗疲勞活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷,且不同批次樣品中4種有效成分含量相差不大。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表11。

表11 樣品含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 11 Test results of sample content determination

3 結(jié)論

本研究選用人參、刺五加、刺玫果三種藥食同源藥材,制備了抗疲勞保健食品雙刺參膠囊。采用HPLC建立了雙刺參膠囊中4種有效成分含量測(cè)定的方法。在檢測(cè)條件下,測(cè)得每粒雙刺參膠囊中含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷分別為0.48、0.66、1.25、0.40 mg,且各有效成分分離度均大于2.0,理論塔板數(shù)均大于20000,符合相關(guān)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,重復(fù)性好,方法穩(wěn)定可行,可用于雙刺參膠囊質(zhì)量控制。

雙刺參膠囊屬中藥類抗疲勞保健食品,在后續(xù)的研究中,將會(huì)借鑒中藥制劑的“一測(cè)多評(píng)”法,使用超高效液相色譜儀,在縮短檢測(cè)時(shí)間的基礎(chǔ)上,探索可同時(shí)測(cè)定雙刺參膠囊中更多有效成分含量的方法,為雙刺參膠囊的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。