朱劍軍，吳 昊

結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均高居消化系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因參與、多步驟的癌變過程。近年來，越來越多的文獻報道組胺與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。組胺能夠顯著增強乳腺癌細胞的放療敏感性，提示組胺能夠作為一種潛在的抗癌佐劑，提高腫瘤患者的放療效果[2]。作為一種具有生理活性的小分子物質(zhì)，組胺通過與組胺受體結(jié)合，傳遞信號，在不同類型細胞中發(fā)揮不用作用[2]。組胺激活組胺1型受體，促進細胞增殖、胚胎發(fā)育和腫瘤生長[4]。激活組胺1型受體和組胺4型受體活性能夠顯著增強乳腺癌細胞的放療敏感性[2]，提示組胺受體蛋白家族可能是治療惡性腫瘤的一組潛在作用靶點。組胺受體3(histamine receptor 3, HRH3)是一種7次跨膜蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[5]。HRH3基因定位于染色體20q13.3，蛋白質(zhì)由445個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為48.6 KD。有研究報道HRH3與肝細胞肝癌、膽管細胞型肝癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-7]。但截至目前，關(guān)于HRH3在結(jié)腸癌生長過程中的作用尚未見相關(guān)報道。本實驗采用轉(zhuǎn)染siRNA片段的方式靶向沉默HRH3基因在結(jié)腸癌細胞中的表達，CCK-8和EdU法監(jiān)測腫瘤細胞生長和增殖活性，qRT-PCR和Western blot法分析相關(guān)信號通路改變，明確HRH3基因在結(jié)腸癌細胞惡性增殖過程中的功能作用，探討相關(guān)分子機制，從而為闡明結(jié)腸癌的發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)，為結(jié)腸癌治療提供潛在作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone公司，美國)，CCK-8(碧云天公司，中國)，EdU細胞增殖檢測試劑盒(銳博公司，中國),Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)，cDNA合成試劑盒、TB Green Advantage qPCR Premix(Takara公司，日本)，HRH3抗體、c-Myc抗體和CDKN1A抗體(Abcam公司，美國)，β-actin抗體、二抗(三鷹公司，中國)。

1.2 細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌Ls174T細胞和SW480細胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞，將細胞接種于6孔板。24 h后，待細胞處于對數(shù)生長期時，進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進行。本課題實驗分3組：空白對照組(只加Lipofectamine)、陰性對照組(si-NC組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA片段)、si-HRH3組(轉(zhuǎn)染si-HRH3片段)。si-HRH3片段正義鏈序列5′-GGAGGAGAAAUGUGC ACUCAU-3′，反義鏈序列3′-CCUCCUCUUUACACGU GAGUA-5′。siRNA片段和陰性對照序列由上海吉碼公司合成。

1.4 qRT-PCR常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞，細胞轉(zhuǎn)染siRNA片段48 h后進行實時熒光定量PCR實驗。提取RNA、cDNA第一條鏈的合成步驟參照試劑盒說明書進行。采用TB Green qPCR Premix完成PCR擴增實驗。擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共計40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。溶解曲線條件按照常規(guī)程序進行。采用2-△△Ct算法計算目的基因的相對表達水平。HRH3引物、c-Myc引物和CDKN1A引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞，細胞轉(zhuǎn)染siRNA片段72 h后進行 Western blot實驗。RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA試劑盒進行蛋白定量。后續(xù)按照常規(guī)步驟進行SDS-PAGE垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。常溫封閉1 h后，一抗孵育過夜。TBST沖洗后，二抗常溫孵育1 h。ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶。HRH3和CDKN1A抗體工作濃度1∶1 000；c-Myc抗體工作濃度1∶2 000；二抗工作濃度1∶10 000。

1.6 CCK-8實驗常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞。轉(zhuǎn)染siRNA片段6 h后將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板。接種時間記為0 h。在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h這5個時間點檢測細胞的生長狀態(tài)。CCK-8溶液孵育1 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測。

1.7 EdU實驗常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞。轉(zhuǎn)染siRNA片段48 h后進行EdU細胞增殖檢測實驗。加入適量EdU工作液，孵育2 h。后續(xù)經(jīng)多聚甲醛固定、沖洗、EdU反應(yīng)、Hoechst染色等步驟完成實驗。最后用倒置熒光顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA對結(jié)腸癌細胞中HRH3表達的影響采用轉(zhuǎn)染siRNA片段的方法沉默HRH3基因表達。在結(jié)腸癌Ls174T和SW480細胞中，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段48 h后，si-HRH3組HRH3 mRNA表達水平降低，分別為82%±4.10%和75%±2.33%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01，圖1)。與空白對照組相比，陰性對照組HRH3 mRNA表達無顯著變化(P>0.05)。Western blot結(jié)果進一步顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段72 h后，Ls174T和SW480細胞中HRH3蛋白水平均顯著降低(圖2)。上述研究表明，轉(zhuǎn)染si-HRH3能夠顯著沉默結(jié)腸癌細胞中HRH3表達水平。

圖1 轉(zhuǎn)染si-HRH3對結(jié)腸癌細胞中HRH3 mRNA表達水平的影響：A.Ls174T細胞；B.SW480細胞；**P<0.01

圖2 轉(zhuǎn)染si-HRH3對HRH3蛋白表達水平的影響：**P<0.01

2.2 HRH3對結(jié)腸癌細胞生長的影響為研究HRH3表達對結(jié)腸癌細胞生長的影響，本實驗首先通過CCK-8實驗檢測沉默HRH3后對結(jié)腸癌細胞生長的影響，結(jié)果顯示，在Ls174T和SW480細胞中，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段后96 h，si-HRH3組細胞生長抑制率分別為39.00%±2.25%和35.54%±3.51%，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01，圖3)。沉默HRH3后，結(jié)腸癌Ls174T和SW480細胞的生長明顯減慢。為進一步驗證HRH3對結(jié)腸癌細胞增殖的影響，本實驗采用EdU實驗檢測結(jié)果表明，在Ls174T細胞中，陰性對照組細胞的增殖率為52.68%±1.33%，si-HRH3組細胞增殖率為23.11%±0.89%，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。在SW480細胞中，陰性對照組與si-HRH3組的細胞增殖率分別為53.69%±2.57%、17.14%±1.46%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。上述實驗結(jié)果表明，沉默HRH3表達能夠有效抑制結(jié)腸癌細胞的惡性生長。

圖3 沉默HRH3對結(jié)腸癌細胞生長的影響：A.Ls174T細胞；B.SW480細胞；**P<0.01

2.3 沉默HRH3對細胞增殖關(guān)鍵分子表達水平的影響為深入研究沉默HRH3抑制結(jié)腸癌細胞增殖的具體分子作用機制，本實驗采用qRT-PCR和Western blot法檢測沉默HRH3后c-Myc和CDKN1A的表達水平。qRT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ls174T和SW480細胞中，與陰性對照組相比，si-HRH3組c-Myc mRNA表達水平均顯著降低，分別為35.11%±1.52%和24.65%±1.80%，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025，P=0.030)；與陰性對照組相比，si-HRH3組CDKN1A mRNA表達水平顯著升高，分別為56.73%±1.44%和55.39%±3.14%，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0093，P=0.015，圖5)。與qRT-PCR結(jié)果一致，Western blot實驗結(jié)果顯示，沉默HRH3后，c-Myc蛋白水平降低(P<0.01)，CDKN1A蛋白水平升高(P<0.01，圖6)。上述研究結(jié)果表明，HRH3可能通過調(diào)控c-Myc和CDKN1A表達水平，影響結(jié)腸癌細胞的惡性增殖。

圖4 沉默HRH3對結(jié)腸癌細胞增殖的影響：A.Ls174T細胞；B.SW480細胞

圖5 沉默HRH3對c-Myc和CDKN1A mRNA表達的影響：A.Ls174T細胞中c-Myc mRNA的表達；B.SW480細胞中c-Myc mRNA的表達；C.Ls174T細胞中CDKN1A mRNA的表達；D.SW480細胞中CDKN1A mRNA的表達；*P<0.05，**P<0.01

圖6 沉默HRH3對c-Myc和CDKN1A蛋白水平的影響**P<0.01

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，2018年全球新增結(jié)腸癌109萬余例，新增死亡55萬余例，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤第三位，病死率高居所有惡性腫瘤第二位[1]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[8]。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞和其它非細胞成分(包括細胞因子、趨化因子等生理活性物質(zhì))共同組成[8]。組胺作為腫瘤環(huán)境中的重要一員，由組氨酸脫氫酶催化L-組氨酸脫羧形成，主要儲存于肥大細胞和嗜堿性粒細胞[3]。近年來，越來越多的研究證實，組胺和組胺受體在炎癥和惡性腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用[9]。

HRH3表達異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5,7]。Lin等[7]報道HRH3在惡性膠質(zhì)瘤中呈高表達，抑制HRH3能夠顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞生長、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HRH3后前列腺癌的生長能力和侵襲活性減弱，細胞凋亡增加。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HRH3在肝細胞肝癌中呈顯著高表達，且激活HRH3后，肝癌細胞的增殖和遷移能力顯著升高[5]。與上述報道一致，本實驗通過轉(zhuǎn)染siRNA片段沉默HRH3表達發(fā)現(xiàn)，沉默HRH3后結(jié)腸癌細胞生長減慢，細胞增殖活性顯著降低，提示HRH3在結(jié)腸癌的發(fā)生進展過程中發(fā)揮促癌作用。然而，F(xiàn)rancis等[10]在膽管細胞型肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)，HRH3激動劑能夠顯著抑制肝癌細胞生長，提示HRH3在膽管細胞型肝癌細胞中發(fā)揮抑癌作用。基于此，作者推測HRH3在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生進展過程中發(fā)揮不同作用，其作用機制有待深入研究。

目前，HRH3促進惡性腫瘤增殖和遷移的作用機制尚未完全闡明。Lin等[7]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)，HRH3通過調(diào)控PI3K/Akt和MEK/ERK信號通路，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的表達，如E-cadherin、ZO-1、vimentin和N-cadherin等，進而促進惡性膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Francis等[10]報道，HRH3通過調(diào)控PKCα依賴的ERK1/2去磷酸化抑制膽管細胞型肝癌細胞生長，提示ERK信號通路參與HRH3介導(dǎo)的膽管細胞型肝癌細胞生長。PI3K/Akt、MEK/ERK等信號通路通過激活下游靶基因，如c-Myc、CDKN1A等，在促進細胞生存和細胞周期進展方面發(fā)揮重要作用[11-14]。c-Myc在多種惡性腫瘤中異常高表達，且c-Myc表達水平與腫瘤細胞惡性增殖活性密切相關(guān)[15]。本實驗通過qRT-PCR和Western blot實驗檢測沉默HRH3后c-Myc的表達水平，結(jié)果顯示，沉默HRH3后，c-Myc mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示HRH3可能通過激活c-Myc信號通路，促進結(jié)腸癌細胞惡性生長。

細胞周期失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤細胞惡性增殖的一個重要始動因素[16]。Bai等[11]報道Akt通過調(diào)控CDK抑制因子CDKN1A，促進腫瘤細胞生存。本實驗發(fā)現(xiàn)，沉默HRH3后，CDKN1A mRNA和蛋白水平均顯著升高，提示HRH3可能通過調(diào)控CDKN1A表達水平，導(dǎo)致細胞周期紊亂，最終促進結(jié)腸癌細胞惡性增殖。然而，HRH3也能通過調(diào)控其它信號途徑影響腫瘤細胞生存[6]。例如，Chen等[6]在前列腺癌細胞中研究發(fā)現(xiàn)，敲除HRH3后，雄激素受體(androgen receptor, AR)表達水平降低，提示HRH3可能通過AR途徑抑制前列腺癌細胞生長、侵襲，促進細胞凋亡。上述研究結(jié)果提示HRH3可能通過激活不同信號通路，促進惡性腫瘤的發(fā)生、進展。

綜上所述，沉默HRH3表達后，結(jié)腸癌細胞的增殖活性減弱，c-Myc表達降低，CDKN1A表達升高?；诖?，推測HRH3可能通過調(diào)控c-Myc和CDKN1A轉(zhuǎn)錄表達，促進結(jié)腸癌細胞惡性增殖。但是，HRH3是如何調(diào)控c-Myc和CDKN1A表達，PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號途徑在HRH3介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞增殖過程中發(fā)揮怎樣的作用，這些問題有待進一步深入探討。