柯藝文，吳 春，張 馨

微小RNA(microRNA, miR)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、血管再生等多種生理病理過(guò)程中起重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miR可作為卵巢漿液性癌的獨(dú)立預(yù)后因子，如miR-613[1]、miR-21[2]等。miR-203定位于人染色體14q32-33，為特異性上皮miR，文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-203在不同類型腫瘤中的表達(dá)水平存在差異，如miR-203在喉癌中表達(dá)降低[3]，而在乳腺癌中表達(dá)增加[4]，目前關(guān)于miR-203在卵巢癌中的表達(dá)情況尚不明確。Tian等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-595在卵巢癌組織樣本及細(xì)胞株中均表達(dá)下降，而關(guān)于miR-595在卵巢漿液性癌中的表達(dá)情況相關(guān)研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595的表達(dá)情況，探討其表達(dá)與患者病情進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系，并評(píng)估其在卵巢漿液性癌預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料收集2011年1月～2014年11月海南省?？谑袐D幼保健院行手術(shù)治療的卵巢漿液性癌手術(shù)組織樣本(癌組織及癌旁正常組織)，共收集45例符合標(biāo)準(zhǔn)的卵巢漿液性癌標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料完整，術(shù)前未接受放、化療及激素治療，術(shù)后病理診斷為卵巢漿液性癌，完成術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾??；合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾??；合并其他惡性腫瘤。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，組織樣本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。采用門診復(fù)查或電子通訊方式，對(duì)患者進(jìn)行為期5年的術(shù)后隨訪，直至隨訪時(shí)間截止或患者死亡，本組45例患者中位隨訪時(shí)間為(48.09±7.49)個(gè)月。Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海碧云天生物公司)，逆轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR引物(金斯瑞生物公司)，SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)，RT-PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 RT-PCRmiRcute miRNA提取分離試劑盒提取組織中的miRNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miR-203逆轉(zhuǎn)錄引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAG TGGT-3′，miR-595逆轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAG-3′。SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，所有操作均嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書，RT-PCR引物：miR-203正向引物5′-ACACTCCAGCTGGCGTGAAATGTTTAGGACCA-3′，反向引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；miR-595正向引物5′-GCGGCAACCCGTAGATCCGAA-3′，反向引物5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-CGCTTCGGCAGCACATATA C-3′，反向引物5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt計(jì)算miR-203、miR-595的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，卵巢漿液性癌組織中miR-203相對(duì)表達(dá)量增加，而miR-595相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595的表達(dá)

2.2 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系卵巢漿液性癌中miR-203表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、CA125表達(dá)無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期有關(guān)(P均<0.05)；miR-595表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑、CA125無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期相關(guān)(P均<0.05，表2)。

2.3 miR-203、miR-595表達(dá)與卵巢漿液性癌患者預(yù)后的關(guān)系以miR-203表達(dá)量中位數(shù)(2.96)為界，將卵巢漿液性癌患者分為miR-203高表達(dá)組(22例)和miR-203低表達(dá)組(23例)，Kaplan-Meier結(jié)果顯示，miR-203高表達(dá)組患者的術(shù)后5年總生存率為18.19%(4/22)，中位生存時(shí)間為26.57個(gè)月，miR-203低表達(dá)組患者的術(shù)后5年總生存率為47.83%(11/23)，中位生存時(shí)間為39.54個(gè)月，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank χ2=5.306，P=0.021，圖1)。

以miR-595表達(dá)量中位數(shù)(0.30)為界，將卵巢漿液性癌患者分為miR-595高表達(dá)組(22例)和miR-595低表達(dá)組(23例)，Kaplan-Meier結(jié)果顯示，miR-595高表達(dá)組患者的術(shù)后5年總生存率為50.00%(11/22)，中位生存時(shí)間為36.27個(gè)月，miR-595低表達(dá)組患者的術(shù)后5年總生存率為17.39%(4/23)，中位生存時(shí)間為30.28個(gè)月，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank χ2=4.311，P=0.038，圖1)。

2.4 Cox回歸模型分析卵巢漿液性癌預(yù)后的影響因素建立Cox比例回歸模型，因變量為卵巢漿液性癌預(yù)后狀況，選擇組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、miR-203表達(dá)、miR-595表達(dá)等5個(gè)指標(biāo)為自變量，回歸過(guò)程采用逐步后退法，以行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高FIGO分期、miR-203高表達(dá)、miR-595低表達(dá)是卵巢漿液性癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05，表3)。

表2 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 卵巢漿液性癌預(yù)后影響因素的分析結(jié)果

圖1 Kaplan-Meier曲線分析miR-203、miR-595表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系：A.miR-203；B.miR-595

2.5 聯(lián)合檢測(cè)miR-203、miR-595對(duì)卵巢漿液性癌的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

2.5.1各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 以本組中死亡病例(30例)為陽(yáng)性樣本，生存病例(15例)為陰性樣本，再將卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595以及當(dāng)前臨床上已用的血清CA125等共3個(gè)指標(biāo)水平劃分成7～9個(gè)組段，建立ROC診斷分析模型。經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示：三指標(biāo)均具有一定的卵巢漿液性癌預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，ROC曲線下面積(AUC)均在0.74以上。在其理論閾值點(diǎn)處，敏感度和特異度也均大于0.7(表4，圖2)。

2.5.2三指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 以該三指標(biāo)各自的閾值為診斷閾值，對(duì)各樣本作陰性或陽(yáng)性判斷。若三指標(biāo)均為一致陽(yáng)性或陰性時(shí)作出樣本的陽(yáng)或陰性診斷，有一個(gè)指標(biāo)不一致時(shí)則對(duì)其進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)未改變時(shí)即認(rèn)可兩指標(biāo)相同的診斷結(jié)果，同時(shí)與臨床醫(yī)師會(huì)商。如此計(jì)算得：血清CA125、癌組織中miR-203、miR-595聯(lián)合檢測(cè)診斷的靈敏度和特異度分別為0.900(27/30)和0.867(13/15)。這說(shuō)明三指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用較之于各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用，可使對(duì)卵巢漿液性癌的預(yù)后預(yù)測(cè)效能得到明顯的提升(表4)。

表4 miR-203、miR-595對(duì)卵巢漿液性癌診斷的ROC結(jié)果

3 討論

卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，但病死率居?jì)D科腫瘤的首位。約90%卵巢癌為卵巢漿液性癌，每年新發(fā)病例數(shù)約22萬(wàn)，死亡病例數(shù)約14萬(wàn)，嚴(yán)重威脅女性生命健康[6]。目前的臨床治療方案可顯著提高患者的生存質(zhì)量，但晚期患者的5年總生存率較低。此外，卵巢漿液性癌發(fā)病隱匿，臨床上亟需尋找靈敏度高的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，以提高患者的早期診斷率、改善患者預(yù)后。卵巢癌近年來(lái)，在腫瘤診斷及治療方面取得了較大進(jìn)展，但卵巢癌患者的5年存活率仍較低，缺乏有效的早期篩查敏感性和特異性均較高的生物標(biāo)志物是重要原因之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR是較為理想的卵巢癌生物標(biāo)志物。

CA125是臨床應(yīng)用最廣泛的血清腫瘤標(biāo)志物，在卵巢癌晚期患者中，其血清水平升高明顯，但近50%早期卵巢癌患者的血清CA125水平無(wú)變化，對(duì)早期患者的診斷靈敏度不高，且其血清水平易受多種生理(如妊娠等)、病理(如子宮內(nèi)膜異位癥等)狀態(tài)影響，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制[7]。

圖2 miR-203、miR-595、CA125對(duì)卵巢漿液性癌預(yù)后預(yù)測(cè)的ROC曲線：A.miR-203；B.miR-595；C.CA125

研究證實(shí)，miR-203與卵巢癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤關(guān)系密切[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，癌組織中miR-203表達(dá)增加，提示miR-203異常高表達(dá)可能參與了卵巢漿液性癌的發(fā)生，發(fā)揮促癌基因作用。Zhao等[9]認(rèn)為miR-203可抑制卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，發(fā)揮抑癌基因功能，與本結(jié)論相悖，筆者初步分析，這可能是組織樣本與細(xì)胞株之間的差異所致，后續(xù)研究將在細(xì)胞水平進(jìn)一步論證本實(shí)驗(yàn)結(jié)論；此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌組織中miR-203高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高FIGO分期相關(guān)，miR-203高表達(dá)患者的術(shù)后5年總生存率低、中位生存時(shí)間短，初步證實(shí)miR-203高表達(dá)可誘發(fā)卵巢漿液性癌的發(fā)生及惡性進(jìn)展。Cox回歸模型結(jié)果顯示，miR-203高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以上結(jié)果證實(shí)，miR-203具有作為卵巢漿液性癌生物標(biāo)志物的潛能。

miR-595是近年研究發(fā)現(xiàn)的新miR分子，其功能尚未明確，有研究證實(shí)miR-595異常表達(dá)與骨髓增生異常綜合征[10]、下頜前突[11]相關(guān)，且可作為肝硬化[12]、炎癥性腸病[13]的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-595在卵巢漿液性癌組織中表達(dá)降低，且與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期及不良預(yù)后相關(guān)，是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-595具有抑癌基因功能，且與卵巢漿液性癌的發(fā)生、惡性進(jìn)展及不良預(yù)后關(guān)系緊密，可作為卵巢漿液性癌的生物標(biāo)志物，與Tian等[5]的研究結(jié)論一致；但有研究發(fā)現(xiàn)，miR-595高表達(dá)可導(dǎo)致白血病細(xì)胞的化療耐藥[14]、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖[15]，提示miR-595同時(shí)具有促癌基因、抑癌基因功能。筆者初步分析，miR-595作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，與靶基因間存在一對(duì)多、多對(duì)一的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且不同腫瘤細(xì)胞中，不同基因的表達(dá)豐度存在較大差異，進(jìn)而導(dǎo)致miR-595可能同時(shí)具有促癌和抑癌功能，后續(xù)研究將深入探究miR-595在卵巢漿液性癌中的分子作用機(jī)制，以期從分子生物學(xué)水平闡述并支持本研究結(jié)論。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-203、miR-595對(duì)卵巢漿液性癌具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，其靈敏度和特異度均在0.7以上，聯(lián)合檢測(cè)CA125、miR-203、miR-595，靈敏度和特異度顯著提升，提示在卵巢漿液性癌的預(yù)后判斷中CA125、miR-203、miR-595聯(lián)合檢測(cè)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，卵巢漿液性癌組織中miR-203高表達(dá)，miR-595低表達(dá)，兩者均是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有作為卵巢漿液性癌生物標(biāo)志物的潛能；檢測(cè)miR-203、miR-595可能有助于卵巢漿液性癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)。