楊瑞卿，易 維，陳科潤(rùn)，錢(qián)瑞儀，司馬秀田

(1.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 成都610041)

顱咽管瘤是顱內(nèi)的常見(jiàn)腫瘤之一，發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，對(duì)顱咽管瘤的防治研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。正常組織的癌變過(guò)程會(huì)伴隨著一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，使得癌變組織逃避凋亡以及繼續(xù)生長(zhǎng)。生長(zhǎng)抑素受體(somatostatin receptor，SSTR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在人體各種組織中普遍表達(dá)，其中腫瘤細(xì)胞中主要表達(dá)SSTR2[1]。在不同類(lèi)型顱咽管瘤組織中檢測(cè)SSTR2的表達(dá)差異，有助于探討SSTR2在顱咽管細(xì)胞癌變發(fā)生以及不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)變關(guān)系，為臨床防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組研究對(duì)象為顱咽管瘤標(biāo)本和腦挫裂傷組織標(biāo)本(對(duì)照組)，均來(lái)自于2010年6月至2011年2月華西醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)接受手術(shù)的患者。根據(jù)如下納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選樣本：納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)家族性疾病病史；②既往無(wú)手術(shù)史；③手術(shù)前無(wú)放療、化療史；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重多器官疾?。虎诤喜⑸眢w其他部位的腫瘤；③術(shù)后病理切片初篩發(fā)現(xiàn)腫瘤組織稀少，大片壞死及血凝塊等雜質(zhì)過(guò)多者。最終收集病例36例，其中男性20例，女性16例。年齡6-62歲，平均29.4歲。釉質(zhì)上皮型腫瘤(adamantinoma epithelium，AE)21例、鱗形乳頭瘤型(squamous papilloma，SP)15例。對(duì)照組標(biāo)本22例，男性15例，女性7例，年齡為22-47歲，平均32.6歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意。手術(shù)切除樣本置于無(wú)菌凍存管中液氮速凍，后移入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 定量PCR

1.2.1主要試劑及來(lái)源 Trizol購(gòu)于美國(guó)羅氏公司，PCR反應(yīng)緩沖液購(gòu)自北京博大泰克公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，2×SYBR購(gòu)自Qiagen公司，引物由上海英俊公司合成，定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2.2Trizol 試劑提取總RNA 取組織塊50 mg用液氮在研缽中研磨成粉末,移入玻璃勻漿器加入1 ml Trizol 抽打勻漿,RNA提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA在260 nm/280 nm處的吸光度值，純度在1.9-2.1者為合格樣品，進(jìn)入后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取1 000 ng RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈：按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明合成。cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4SSTR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 以cDNA作為模板，β-actin作為內(nèi)參照， DEPC水作為陰性對(duì)照，對(duì)SSTR2 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。SSTR2引物：SSTR2上游：5′-TGCTGGGTCTGCCTTTCTTGG-3′；下游：5′-AGAAGATGCTGGTGAACTGATTGATG-3′。β-actin引物：上游：5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′；下游：5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR 10 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl ，DEPC水補(bǔ)足20 μl。PCR反應(yīng)條件：①94℃預(yù)變性2 min②94℃變性15 sec③60℃退火30 sec④72℃延伸30 sec⑤擴(kuò)增40循環(huán)次數(shù)⑥72℃延伸加時(shí)10 min⑦4℃保存。以2-ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 顱咽管瘤影像學(xué)資料

顱咽管瘤代表性核磁共振資料見(jiàn)圖1，圖中顯示，腫瘤起源于鞍上，腫瘤有不均一強(qiáng)化，囊變，累及下丘腦進(jìn)入三腦室內(nèi)，接近中腦。

圖1 顱咽管瘤典型影像學(xué)表現(xiàn)

2.2 定量PCR檢測(cè)SSTR2基因在顱咽管瘤組織中的表達(dá)

定量PCR結(jié)果顯示：顱咽管瘤組織和對(duì)照組織中SSTR2 mRNA的相對(duì)含量分別為0.642和0.242，與對(duì)照組相比，SSTR2 mRNA的相對(duì)含量明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 顱咽管瘤和對(duì)照組SSTR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

aP<0.05，vs control

2.3 SSTR2mRNA在不同顱咽管瘤病理類(lèi)型中的表達(dá)

SSTR2基因在顱咽管瘤兩種不同病理類(lèi)型(AE和SP)中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：AE類(lèi)型SSTR2基因表達(dá)明顯強(qiáng)于SP，其相對(duì)含量分別為0.811量分別為表同和0.467量分別為表同，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 SSTR2 mRNA在不同顱咽管瘤病理類(lèi)型中的表達(dá)

aP<0.05，vs control

3 討論

顱咽管正常細(xì)胞的癌變過(guò)程包含多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變，特別是G蛋白耦連信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變，進(jìn)而引起細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的改變，包括原癌基因的活化和抑癌基因的失活等，因此從信號(hào)傳導(dǎo)通路方面抑制癌變的發(fā)生具有非常重要的臨床意義。生長(zhǎng)抑素作為一種由體內(nèi)多種組織產(chǎn)生分泌并且廣泛存在的激素，其主要作用抑制垂體生長(zhǎng)激素和胃泌素的分泌，也可作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，在人體內(nèi)起著重要的調(diào)節(jié)作用，其主要的受體是SSTR[2]。SSTR作為G蛋白耦連信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的受體，在細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)換過(guò)程中起著不可或缺的作用，既可以通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶-cAMP途徑，進(jìn)而使cAMP的水平降低，從而阻止原癌基因的激活，抑制細(xì)胞的增殖，也可以通過(guò)MAPK途徑使酪氨酸激酶失活，從而阻止細(xì)胞的增殖[3]。

本研究運(yùn)用定量PCR檢測(cè)顱咽管瘤中SSTR2基因的表達(dá)，結(jié)果顯示顱咽管瘤組織中SSTR2基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示生長(zhǎng)抑素及其類(lèi)似物可能對(duì)抑制顱咽管瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的效果，奧曲肽等生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物藥物可能具有不錯(cuò)的療效，但奧曲肽的治療需要大劑量服用，且長(zhǎng)期服用可能具有副作用，產(chǎn)生耐藥性[4]。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果也顯示釉質(zhì)上皮型(AE)的SSTR2基因表達(dá)明顯強(qiáng)于鱗形乳頭瘤型(SP)，對(duì)于AE型顱咽管瘤的奧曲肽等生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物的治療效果可能優(yōu)于SP型，但是也不可忽略生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物對(duì)于SP型顱咽管腫瘤的治療作用。如果奧曲肽的治療效果未達(dá)到預(yù)期的療效，可采用生長(zhǎng)激素抑制物結(jié)合奧曲肽的治療[4]。有研究表明，過(guò)表達(dá)SSTR2可以對(duì)內(nèi)源性SSTR2表達(dá)陽(yáng)性和陰性的腫瘤具有顯著的抑制效果，亦可以考慮SSTR2的轉(zhuǎn)基因治療[5]。國(guó)外之前報(bào)道，SSTR與表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)常常在細(xì)胞上呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[6]，EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，能夠刺激細(xì)胞的增殖。因此對(duì)于腫瘤的治療，不僅僅只是通過(guò)激活SSTR來(lái)抑制細(xì)胞的增殖，也需要通過(guò)提高SSTR的水平來(lái)降低EGFR的濃度，從而抵消EGFR的作用。因此對(duì)于較低表達(dá)SSTR2的SP型顱咽管瘤，可以通過(guò)提高SSTR水平的藥物或SSTR的轉(zhuǎn)基因來(lái)治療。

此外，有研究顯示，采用原子量為177的放射性元素镥(Lu)在螯合劑DOTA(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸)的作用下與酪氨酸(Tyr)-奧曲肽相偶聯(lián),在合適劑量的情況下，這種通過(guò)生長(zhǎng)抑素受體介導(dǎo)的放射治療可以產(chǎn)生不錯(cuò)的抗腫瘤效果，并且對(duì)正常組織不會(huì)產(chǎn)生較大的毒害作用[7]。而在本實(shí)驗(yàn)中，顱咽管瘤的SSTR2水平顯著高于對(duì)照組織，對(duì)該種螯合治療劑敏感，可能只需較小的劑量便可獲得意想不到的療效，并且也不會(huì)像通常的放射性治療一樣對(duì)身體造成很大的傷害，有望成為臨床上治療顱咽管瘤的一種新方法。