鄭云鵬 李旭陽 蔡丙杰 李冬芹 尹光文

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科450052

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡稱皮膚鱗癌）是一種常見的皮膚惡性腫瘤，部分患者可發(fā)生快速轉(zhuǎn)移，影響皮膚外觀和預(yù)后［1-4］。早期快速準(zhǔn)確地控制腫瘤進(jìn)展對患者具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）均為常見的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），其在機體癌癥中的促進(jìn)功能或者抑制功能均已得到很多研究的認(rèn)可［5-6］。lncRNA LEF1-AS1 在多種癌癥中均已有研究報道，但是在皮膚鱗癌中的功能及機制尚不清楚。本實驗通過生物信息學(xué)預(yù)測LncRNA LEF1-AS1 的靶向miRNA，發(fā)現(xiàn)LncRNA LEF1-AS1 與miR-612 有結(jié)合位點，且研究報道LncRNA LINC00460通過使miR-612海綿化可促進(jìn)頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［7］。但miR-612在皮膚鱗癌中的功能尚不清楚。本研究以皮膚鱗癌細(xì)胞SCC13 為研究對象，檢測lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達(dá)，觀察干擾lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達(dá)對其增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。

材料與方法

一、實驗材料

收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018 年3 月至2019 年6 月外科手術(shù)切除的20例皮膚鱗癌及對應(yīng)的癌旁組織。本研究符合2013 年修訂的《赫爾辛基 宣 言》（https：//www.wma.net/policies-post/wmadeclaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medicalresearch-involving-human-subjects/）的要求，所有受試者均簽署知情同意書。

SCC13細(xì)胞（編號：CVCL_4029）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRTPCR）檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）；LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen 公司，規(guī)格：1.5 ml）；CCK8 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；遷移實驗（Transwell）小室（美國Corning 公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）。 流 式 細(xì) 胞 儀（Cytomics FC 500，美 國BECKMANCOULTER公司）。

二、qRT-PCR法檢測組織中皮膚鱗癌及癌旁組織中LEF1-AS1、miR-612的表達(dá)

將充分研磨的組織用RNA提取試劑盒抽提總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA，采用qRT-PCR 檢測試劑盒檢測lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達(dá)，以GAPDH、U6為內(nèi)參，引物由南京科佰生物科技有限公司合成，序列見表1，以2-△△Ct法分析lncRNA LEF1-AS1、miR-612的相對表達(dá)量。

三、SCC13細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)和傳代SCC13 細(xì)胞。按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 試劑的說明書操作將lncRNA LEF1-AS1 的干擾無意義序列（si-NC）、lncRNA LEF1-AS1 的干擾序列（si-LEF1-AS1）、miR-612 過表達(dá)的無意義序列（miR-NC）、miR-612 過表達(dá)基因序列（miR-612）轉(zhuǎn)染至SCC13 細(xì)胞，記為si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、miR-NC組、miR-612組；將si-LEF1-AS1分別與抑制miR-612 表達(dá)的無意義序列（anti-miR-NC）、抑制miR-612 表達(dá)基因序列（anti-miR-612）共轉(zhuǎn)染至SCC13 細(xì)胞中，記為si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組和si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組；各組在轉(zhuǎn)染8 h后棄去培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染的效率，確定轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實驗研究。

四、干擾lncRNA LEF1-AS1表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取si-NC 組、si-LEF1-AS1 組SCC13 細(xì)胞，采用CCK8 法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況，Transwell試驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力，Western印跡檢測增殖相關(guān)蛋白細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（cyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑（p21），凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax），遷移及侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的相對水平。

1.CCK8 法檢測細(xì)胞增殖：以100 μl、5×105個細(xì)胞置于96孔板中，培養(yǎng)24、48、72 h，加入20 μl的CCK8溶液，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長檢測各組細(xì)胞的吸光度（A值）。以A值反映細(xì)胞的增殖能力。

2.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡：收集細(xì)胞，使用結(jié)合緩沖液重懸，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書要求操作，避光孵育待測細(xì)胞，快速上流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞的凋亡情況。凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。

3.Transwell 試驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力：收集細(xì)胞，先用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取1×105/ml 細(xì)胞100 μl 均勻鋪在上室表面，下室內(nèi)加入700 μl含有血清的培養(yǎng)基，將小室置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室后，進(jìn)行甲醇固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取5個視野拍照，計算平均值。選用含有基質(zhì)膠的小室檢測細(xì)胞的侵襲能力，不含基質(zhì)膠的小室檢測細(xì)胞的遷移能力。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR引物信息

4.Western印跡試驗：收集細(xì)胞，裂解后提取總蛋白，使用BCA 法對蛋白進(jìn)行定量。目的蛋白沸水浴變性處理，取上清液上樣電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜轉(zhuǎn)移至一抗溶液（1∶500）中，4 ℃下孵育過夜。將膜轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的二抗稀釋液（1∶1 000）中，室溫孵育2 h，通過超敏ECL 發(fā)光試劑盒顯影、定影、曝光。使用Quantity One 4.6軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為參照，以目的條帶灰度值與GAPDH 條帶的比值為cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對表達(dá)水平。

五、過表達(dá)miR-612對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取miR-NC 組、miR-612 組SCC13 細(xì)胞，采用CCK8 法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況，Transwell 試驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力，Western 印跡檢測cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對水平。

六、lncRNA LEF1-AS1 與miR-612 的結(jié)合能力檢測

用LncBase Predicted v.2 在線預(yù)測網(wǎng)站（http：//carolina.imis.athena - innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r=lncbasev2%2Findex-predicted）預(yù) 測lncRNA LEF1-AS1 與miR-612 之間的互補序列，根據(jù)互補序列設(shè)計合成有互補結(jié)合位點的WT-LEF1-AS1序列和無互補結(jié)合位點的MUT-LEF1-AS1序列（圖1），并將其克隆至熒光載體上，構(gòu)建熒光素酶報告基因質(zhì)粒，分別與miR-NC、miR-612 共轉(zhuǎn)染至SCC13細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒要求操作，檢測細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者的比值表示報告基因的表達(dá)水平。

將LEF1-AS1過表達(dá)的無意義序列（LEF1-AS1-NC）、LEF1-AS1 過表達(dá)基因序列（LEF1-AS1）、si-NC、si-LEF1-AS1 轉(zhuǎn)染至SCC13 細(xì)胞中，采用qRT-PCR 法檢測各組細(xì)胞miR-612 的相對表達(dá)水平，以檢測lncRNA LEF1-AS1 對miR-612 的調(diào)控作用。

圖1 根據(jù)長鏈非編碼RNA LEF1-AS1與微小RNA-612（miR-612）之間的互補序列設(shè)計的互補和不互補序列WT-LEF1-AS1：有互補結(jié)合位點的序列；MUT-LEF1-AS1：無互補結(jié)合位點的序列

七、干擾lncRNA LEF1-AS1 及抑制miR-612 表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、si-LEF1-AS1 +anti-miR-NC 組、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞miR-612的相對表達(dá)，CCK8法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況，Transwell 試驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力，Western 印跡檢測cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對水平。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、lncRNA LEF1-AS1 和miR-612 在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)

皮膚鱗癌組織中的lncRNA LEF1-AS1 相對表達(dá)（2.93±0.29）高于癌旁皮膚組織（1.00±0.08，t=28.69，P ＜0.001），miR-612 的相對表達(dá)（0.52 ±0.05）低于癌旁皮膚組織（1.01±0.09，t=21.28，P ＜0.001）。

二、干擾lncRNA LEF1-AS1 表達(dá)對SCC13 增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

見圖2、表2。si-LEF1-AS1 組細(xì)胞lncRNA LEF1-AS1 相對表達(dá)低于si-NC 組（P ＜0.05）；24、48、72 h 時細(xì)胞增殖能力低于si-NC 組（均P ＜0.05），細(xì)胞凋亡率高于si-NC 組（P ＜0.05），遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-NC組（均P ＜0.05）。

Western 印跡顯示，si-LEF1-AS1組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白cyclinD1相對水平低于si-NC 組（P ＜0.05），p21 相對水平高于si-NC 組（P ＜0.05）；凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2相對水平低于si-NC組（P ＜0.05），Bax相對水平高于si-NC 組（P ＜0.05）；遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9 相對水平均低于si-NC 組（均P ＜0.05）。見圖3、表3。

三、miR-612 過表達(dá)對SCC13 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

miR-612 組細(xì)胞miR-612 相對表達(dá)高于miRNC 組（P ＜0.05）；24、48、72 h 時miR-612 組細(xì)胞增殖能力低于miR-NC 組（均P ＜0.05）；miR-612組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC 組（P ＜0.05）；miR-612 組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均低于miR-NC組（均P ＜0.05）。見圖4、表4。

圖2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達(dá)后SCC13細(xì)胞的凋亡、遷移、侵襲能力 2A：流式細(xì)胞儀檢測，si-LEF1-AS1組細(xì)胞凋亡率高于si-NC組；2B：Transwell試驗檢測，si-LEF1-AS1組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-NC組。si-NC，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

表2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

表2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

注：n=9。si-NC：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

分組LEF1-AS1表達(dá)（2-△△Ct）細(xì)胞增殖能力（吸光度）24 h 0.33±0.03 0.29±0.03 2.83 0.012 48 h 0.69±0.06 0.37±0.03 14.32＜0.001 72 h 1.01±0.09 0.51±0.05 14.57＜0.001凋亡率（%）遷移細(xì)胞數(shù)（個）侵襲細(xì)胞數(shù)（個）si-NC si-LEF1-AS1 t值P值1.00±0.08 0.49±0.04 17.10＜0.001 7.36±0.71 21.69±2.13 19.15＜0.001 82.65±8.12 37.69±3.34 15.36＜0.001 69.48±6.87 29.64±3.36 15.63＜0.001

圖3 Western 印跡檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1 表達(dá)后SCC13 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá) 3A：si-LEF1-AS1 組cyclinD1 相對水平低于si-NC 組，p21 相對水平高于si-NC 組；3B：Bcl-2 相對水平低于si-NC 組，Bax 相對水平高于si-NC 組；3C：MMP-2、MMP-9相對水平均低于si-NC組。si-NC，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

表3 Western印跡檢測干擾lncRNA LEF1-AS1表達(dá)后SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

表3 Western印跡檢測干擾lncRNA LEF1-AS1表達(dá)后SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）

注：n=9。si-NC：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

分組 增殖相關(guān)蛋白cyclinD1 0.65±0.06 0.24±0.03 18.34＜0.001 p21 0.31±0.03 0.73±0.06 18.78＜0.001凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 0.69±0.06 0.27±0.03 18.78＜0.001 Bax 0.37±0.03 0.78±0.07 16.15＜0.001遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2 0.83±0.07 0.39±0.04 16.37＜0.001 MMP-9 0.61±0.06 0.22±0.03 17.44＜0.001 si-NC si-LEF1-AS1 t值P值

Western印跡顯示，miR-612組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白cyclinD1 相對水平低于miR-NC 組（P ＜0.05），p21 相對水平高于miR-NC 組（P ＜0.05）；凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2相對水平低于miR-NC組（P ＜0.05），Bax相對水平高于miR-NC 組（P ＜0.05）；遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9相對水平均低于miR-NC 組（均P ＜0.05）。見圖5、表5。

四、lncRNA LEF1-AS1 靶向調(diào)控SCC13 細(xì)胞miR-612的表達(dá)

共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LEF1-AS1后，miR-612組細(xì)胞熒光活性（0.33 ± 0.03）低于miR-NC 組（1.00 ± 0.09，t =21.19，P ＜0.001）；而共轉(zhuǎn)染MUT-LEF1-AS1 后，miR-612 組細(xì)胞熒光活性（0.97 ± 0.07）與miR-NC組（0.98 ± 0.08）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.28，P =0.78）。

圖4 miR-612 過表達(dá)對SCC13 細(xì)胞的凋亡、遷移、侵襲能力的影響 4A：流式細(xì)胞儀檢測，miR-612 組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC 組；4B：Transwell試驗檢測，miR-612組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均低于miR-NC組。miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)的無意義序列；miR-612組，轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)基因

表4 miR-612過表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

表4 miR-612過表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

注：n=9。miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)的無意義序列；miR-612組：轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)基因

分組miR-612（2-△△Ct）凋亡率（%）遷移細(xì)胞數(shù)（個）miR-NC miR-612 t值P值0.99±0.07 2.68±0.26 18.83＜0.001增殖能力（吸光度）24 h 0.35±0.03 0.32±0.03 2.12 0.049 28 h 0.67±0.06 0.43±0.04 9.98＜0.001 72 h 1.03±0.09 0.57±0.05 13.40＜0.001 6.89±0.67 18.46±1.73 18.71＜0.001 83.65±8.41 43.66±4.39 12.64＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個）71.64±7.32 34.69±3.87 13.33＜0.001

圖5 Western印跡檢測干擾miR-612過表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 5A：miR-612組cyclinD1相對水平低于miR-NC組，p21相對水平高于miR-NC組；5B：Bcl-2相對水平低于miR-NC組，Bax相對水平高于miR-NC組；5C：MMP-2、MMP-9相對水平均低于miR-NC組

表5 Western印跡檢測miR-612過表達(dá)對SCC13細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響（±s）

表5 Western印跡檢測miR-612過表達(dá)對SCC13細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響（±s）

注：n=9。miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)的無意義序列；miR-612組：轉(zhuǎn)染miR-612過表達(dá)基因

分組 增殖相關(guān)蛋白cyclinD1 0.66±0.06 0.29±0.03 16.55＜0.001 p21 0.30±0.03 0.68±0.06 16.99＜0.001凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 0.71±0.06 0.33±0.03 16.99＜0.001 Bax 0.36±0.03 0.75±0.06 17.44＜0.001遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2 0.85±0.07 0.43±0.04 15.63＜0.001 MMP-9 0.62±0.06 0.26±0.03 16.10＜0.001 miR-NC miR-612 t值P值

LEF1-AS1-NC 組、LEF1-AS1 組、si-NC 組、si-LEF1-AS1 組細(xì)胞miR-612 的相對表達(dá)分別為1.00±0.09、0.49±0.04、1.01±0.08、2.53±0.25，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=356.62，P ＜0.001），LEF1-AS1組低于LEF1-AS1-NC 組（LSD-t =15.54，P ＜0.05），si-LEF1-AS1 組高于與si-NC 組（LSD-t=17.33，P ＜0.05）。

五、干擾lncRNA LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、si-LEF1-AS1+antimiR-NC 組、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組細(xì)胞間miR-612 的相對表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，24、48、72 h 時的增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義，凋亡率（圖6）、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)（圖7）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。si-LEF1-AS1 組細(xì)胞中miR-612表達(dá)高于si-NC組，48、72 h細(xì)胞增殖能力低于si-NC組，細(xì)胞凋亡率高于si-NC組，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-NC 組（均P ＜0.05），而si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組細(xì)胞中miR-612 表達(dá)低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組，48、72 h 細(xì)胞增殖能力高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組，細(xì)胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組（均P ＜0.05）。見表6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞凋亡的影響 si-LEF1-AS1組細(xì)胞凋亡率高于si-NC組（P ＜0.05）；si-LEF1-AS1+anti-miR-612組細(xì)胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組。si-NC，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列；anti-miR-NC，轉(zhuǎn)染抑制miR-612表達(dá)的無意義序列；anti-miR-612，轉(zhuǎn)染抑制miR-612表達(dá)基因

圖7 Transwell試驗檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 si-LEF1-AS1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-NC組；si-LEF1-AS1+anti-miR-612組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組

Western 印跡顯示，4 組細(xì)胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.001），si-LEF1-AS1 組cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平均低于si-NC 組，p21、Bax 蛋白相對水平高于si-NC 組（均P ＜0.05）；而si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組，p21、Bax 蛋白相對水平低于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組（均P ＜0.05）。見圖8、表7。

討 論

Zong 等［8］報道，lncRNA LEF1-AS1 在食管鱗癌組織中的表達(dá)異常上調(diào)，并與患者的淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期具有顯著的相關(guān)性，提示lncRNA LEF1-AS1可能是參與食管鱗癌臨床進(jìn)展的lncRNA，可作為潛在的預(yù)測指標(biāo)。Zhang等［9］在口腔鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA LEF1-AS1在組織和細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高，且與患者預(yù)后不良相關(guān)，下調(diào)lncRNA LEF1-AS1能夠在體外抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)凋亡并發(fā)生G0/G1期阻滯，在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤的生長，產(chǎn)生這種影響的作用機制與抑制Hippo信號通路活性具有明顯的相關(guān)性，提示lncRNA LEF1-AS1 通過抑制Hippo 信號通路，從而在口腔鱗癌中發(fā)揮致癌作用。由此，我們推測lncRNA LEF1-AS1可能在皮膚鱗癌中也具有致癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LEF1-AS1 在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)異常升高，干擾lncRNA LEF1-AS1 表達(dá)后，皮膚鱗癌細(xì)胞SCC13的增殖能力、遷移侵襲能力均受到明顯的抑制，細(xì)胞的凋亡明顯增強，這些試驗結(jié)果均與lncRNA LEF1-AS1 在食管鱗癌和口腔鱗癌中的功能相呼應(yīng)，提示其在皮膚鱗癌中也發(fā)揮致癌的功能。

表6 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移侵襲的作用（±s）

表6 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞增殖、凋亡、遷移侵襲的作用（±s）

注：n=9。si-NC：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1 的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1 的干擾序列；anti-miR-NC，轉(zhuǎn)染抑制miR-612 表達(dá)的無意義序列；anti-miR-612，轉(zhuǎn)染抑制miR-612表達(dá)基因。a與si-NC 組比較，P ＜0.05；b與si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組比較，P ＜0.05

增殖能力（吸光度）分組miR-612（2-△△Ct）si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 F值P值1.00±0.08 2.59±0.25a 2.56±0.26 1.41±0.14b 150.78＜0.001 24 h 0.34±0.03 0.31±0.03 0.29±0.03 0.33±0.04b 4.12 0.014 48 h 0.68±0.06 0.41±0.04a 0.38±0.03 0.57±0.04b 92.57＜0.001 72 h 1.05±0.09 0.56±0.05a 0.52±0.05 0.89±0.08b 122.15＜0.001凋亡率（%）7.74±0.76 22.64±2.24a 23.45±2.31 13.58±1.36b 160.34＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)（個）85.69±8.55 39.65±3.87a 38.46±3.76 73.24±7.33b 131.67＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個）70.25±7.23 30.66±3.18a 28.79±2.87 59.68±5.44b 155.60＜0.001

圖8 Western印跡檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表達(dá)對SCC13 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平，si-LEF1-AS1組低于si-NC 組，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組；p21、Bax蛋白相對水平，si-LEF1-AS1 組高于si-NC 組，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組

miRNA 既可作為lncRNA 的靶標(biāo)，還可作為靶基因的直接上游調(diào)控因子，其在癌癥中的功能得到普遍認(rèn)可［10］。miR-612在肝癌、黑素瘤中均表達(dá)異常［11-12］，發(fā)揮調(diào)控癌癥進(jìn)展的作用，但在皮膚鱗癌中的作用尚未十分清楚。Kang等［13］在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-612 的表達(dá)異常降低，且與患者的臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，過表達(dá)miR-612能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡，阻止裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長，其機制為miR-612 靶向含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白4（BRD4）進(jìn)而抑制PI3K/Akt 信號通路的活性，揭示miR-612/BRD4/PI3K/Akt信號通路在非小細(xì)胞肺癌中的功能，提示miR-612可能成為非小細(xì)胞肺癌患者抗癌治療的潛在靶標(biāo)。Sheng 等［14］在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-612在結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，并且miR-612 在體外抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，miR-612 直接靶向抑制AKT2，進(jìn)而抑制下游的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號通路，說明miR-612 在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。目前，miR-612 在皮膚鱗癌中的功能尚不清楚，我們推測其在皮膚鱗癌中也具有相似的抑癌作用。CyclinD1、p21 均是細(xì)胞周期調(diào)控因子，CyclinD1 高表達(dá)，p21 低表達(dá)，提示細(xì)胞增殖增多［15］。Bcl-2、Bax 是凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2 抗凋亡，Bax 促凋亡［16］。MMP-2、MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲［17］。本研究發(fā)現(xiàn)干擾LncRNA LEF1-AS1 表達(dá)和miR-612 過表達(dá)后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，p21、Bax蛋白表達(dá)顯著升高。表明干擾LncRNA LEF1-AS1表達(dá)和miR-612 過表達(dá)可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲，促進(jìn)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-612在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)異常降低，過表達(dá)miR-612具有與干擾lncRNA LEF1-AS1 相類似的抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)凋亡的作用。

表7 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表7 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達(dá)對SCC13細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=9。注：si-NC：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉(zhuǎn)染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列；anti-miR-NC，轉(zhuǎn)染抑制miR-612表達(dá)的無意義序列；anti-miR-612，轉(zhuǎn)染抑制miR-612表達(dá)基因。a 與si-NC 組比較，P ＜0.05；b與si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組比較，P ＜0.05

分組 增殖相關(guān)蛋白cyclinD1 0.64±0.06 0.26±0.03a 0.25±0.03 0.53±0.05b p21 0.32±0.03 0.74±0.06a 0.75±0.07 0.43±0.03b凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 0.70±0.06 0.29±0.03a 0.28±0.03 0.59±0.05b Bax 0.35±0.03 0.79±0.06a 0.80±0.08 0.46±0.04b遷移、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2 0.84±0.07 0.38±0.03a 0.37±0.04 0.72±0.07b MMP-9 0.59±0.06 0.23±0.03a 0.22±0.03 0.48±0.04b si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 174.68＜0.001 166.60＜0.001 206.13＜0.001 151.87＜0.001 167.10＜0.001 175.20＜0.001 F值P值

我們通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證，lncRNA LEF1-AS1 可靶向作用miR-612，猜測這可能與lncRNA LEF1-AS1在皮膚鱗癌中的功能具有聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-612能夠逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA LEF1-AS1 對皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的調(diào)控作用。提示在皮膚鱗癌中，lncRNA LEF1-AS1 可能通過miR-612 發(fā)揮調(diào)控皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突