喬瑩，馬笑晚，邵彥翔，陳超

( 1. 自然資源部第四海洋研究所，廣西 北海 536000；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

1 引言

本尼登蟲作為世界海水養(yǎng)殖魚類的一種主要的寄生性單殖吸蟲，隸屬于吸蟲綱（Trematoda）單殖吸蟲目（Monogenea）分室科（Capsalidae Bard, 1853）本尼登亞科（Benedeniinae Johnston, 1931），多分布于熱帶和亞熱帶海區(qū)。本尼登蟲的宿主特異性較低，寄生宿主種類廣泛，包括各類石斑魚（Epinephelinae）、大黃魚（Larimichthys crocea）、金目鱸（Lates calcarifer）、真鯛（Pagrus major）等多種野生及養(yǎng)殖品種。本尼登蟲主要以蟲體前后吸器及鉤狀結(jié)構(gòu)吸附寄生于各類海洋魚類的體表、鰭條、鰓絲等部位，破壞魚類黏液組織，吸食宿主的表皮細(xì)胞及血液，營(yíng)寄生生活。由于其寄生還可造成魚體表面創(chuàng)傷，引發(fā)繼發(fā)性的細(xì)菌感染，造成宿主死亡。至今關(guān)于本尼登蟲病感染的報(bào)道屢見不鮮[1-4]，有研究表明新本尼登蟲已成為世界漁業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中最主要的單殖類寄生蟲[5-6]，其宿主自然感染率高達(dá)70%，發(fā)病魚死亡率平均在30%～40%，最高甚至可達(dá)90%以上，給養(yǎng)殖業(yè)者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

以往寄生蟲分類方法是以傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察為主，依靠觀察描述蟲體及其器官的形態(tài)、大小及位置，并記錄測(cè)量相關(guān)數(shù)據(jù)來進(jìn)行形態(tài)鑒定。但傳統(tǒng)分類學(xué)方法對(duì)鑒定者經(jīng)驗(yàn)要求較高，且壓片制片過程對(duì)于蟲體及器官的位置和大小影響較大，故常存在同種異名的情況，引起分類歸屬的爭(zhēng)議。新本尼登蟲的分類爭(zhēng)議同樣存在，其爭(zhēng)議點(diǎn)主要存在于新本尼登屬的10個(gè)種是否存在同種異名的情況。Whttington和Horton[7]于1996年將已有報(bào)道的10種新本尼登蟲重新進(jìn)行分類，僅保留了 Neobenedenia melleni、N. adenea、N.isabellae、 N. longiprostata、 N. muelleri和 N. pacifica 6個(gè)種，N. girellae和N. pargueraensis被分為N. melleni的同種異名，但仍有學(xué)者對(duì)此分類持不同意見[8]。以核糖體基因（rRNA）和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（First Internal Transcribed Spacer，ITS）等為分子標(biāo)記[9-13]在分子分類學(xué)研究的應(yīng)用，很好地解決了傳統(tǒng)分類學(xué)方法的局限性，同時(shí)，鑒于該方法避免了樣品處理對(duì)蟲體形態(tài)的影響與人為形態(tài)觀察的主觀性，其已成為寄生蟲分類的一種重要方法。

本研究針對(duì)印度尼西亞峇淡島海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖的卵形鯧鲹 Trachinotus ovatus （Linnaeus，1758）體表寄生的本尼登類單殖吸蟲的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察和測(cè)量，并結(jié)合其28S rRNA基因序列的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，以確定危害印度尼西亞峇淡島海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類的本尼登類單殖吸蟲種類，從而為該地區(qū)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類本尼登蟲病的防治提供依據(jù)，為國(guó)家一帶一路海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 標(biāo)本采集

2017 年12 月于印度尼西亞峇淡島海域（0°38′19″N，104°15′23″E）海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱采集感染本尼登蟲的卵形鯧鲹，寄生部位：體表、鰭條、鰓絲。經(jīng)淡水浸泡后，收集脫落的寄生本尼登蟲蟲株（Isolate Batam, IB）。蟲株分別使用10%中性甲醛和90%無水乙醇固定待用。

2.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量

采集蟲體使用蓋玻片和載玻片輕輕壓片后，使用10%中性甲醛進(jìn)行固定。使用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡對(duì)固定蟲體形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察和測(cè)量。測(cè)量的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)包括體長(zhǎng)，體寬，前吸器長(zhǎng)、寬，后吸器長(zhǎng)、寬，咽長(zhǎng)、寬，邊緣膜，附甲片，前鉤長(zhǎng)，后鉤長(zhǎng)，卵巢長(zhǎng)、寬，睪丸長(zhǎng)、寬，共16組數(shù)據(jù)，測(cè)量單位均以μm計(jì), 測(cè)量蟲體數(shù)目為15～30 個(gè), 并計(jì)算算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 28S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序

將使用適量90%無水乙醇固定的蟲株樣品，充分研磨后，12 000 r/min離心5 min，去除上清，使用無菌水重懸，充分洗滌樣品，去除無水乙醇。蟲體基因組DNA提取采用EasyPure?海洋動(dòng)物基因組DNA試劑盒（Transgen Biotech，EE151-01），DNA 抽提與純化步驟參照說明書進(jìn)行。

28S rRNA擴(kuò)增引物選用C1: 5′-ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3′和 C3: 5′-CTCTTCAGAGTAC TTTTCAAC-3′[14]。擴(kuò)增體系為：DNA模板 0.5 ng，PCR 預(yù)混體系 10 μL、Taq DNA 聚合酶 0.6 μL、上游引物C11μL、下游引物C31μL、加入無菌水至總體積50 μL。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性 30 s、55℃ 退火 45 s、72℃ 延伸2min、40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用EasyPure?凝膠回收試劑盒（Transgen Biotech, EG101-01）純化。純化產(chǎn)物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

測(cè)序序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選取同源序列，使用MEGA X[15]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果使用 ESPript軟件（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）進(jìn)行可視化展示。使用PhyML 3.0軟件[16]進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，自動(dòng)模型選擇使用赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike Information Criterion）模型，進(jìn)化樹改良類型選擇SPR（Subtree Prune Regraft）。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)描述

圖1 鱾新本尼登蟲峇淡島蟲株形態(tài)圖Fig.1 Morphological structure of Neobenedenia girellae isolate Batam

形態(tài)描述：如圖1所示，蟲體呈現(xiàn)長(zhǎng)橢圓形，體前部具有兩個(gè)前吸器，體后部具有1個(gè)后吸器；體長(zhǎng)（包括 后 吸 器 ） 為2976.54～4186.16 μm（（3 275.33 ±516.12） μm），體寬1739.49～2 189.76 μm（（1 922.41 ±189.27） μm）；前吸器呈并列的吸盤狀，大小為 [ 279.95～472.47 μm（（364.37 ± 70.75） μm）]×[ 242.53～382.82 μm（（323.61 ± 51.62） μm）]；前吸器后具有兩對(duì)眼點(diǎn)，前小后大，呈八字形排列，位于咽之前。咽呈圓形，邊緣具有缺刻，大小為[ 274.80～553.95 μm（（390.37 ± 109.24） μm）]×[ 426.57～685.19 μm（（520.94±101.41） μm）]；腸管于咽之后分叉，向后延伸至蟲體末端形成盲端，并向蟲體中央及邊緣發(fā)出眾多外側(cè)分支。卵球形睪丸1對(duì)，并列排列于蟲體中部，邊緣具缺刻，大小為[ 330.57～440.95 μm（（398.31 ± 45.77） μm）]×[ 280.06～392.71 μm（（308.23 ± 47.57） μm）]；卵巢位于蟲體中部睪丸之前，無陰道結(jié)構(gòu)，大小為 [ 235.43～292.62 μm（（262.47 ±21.83） μm）]×[ 235.99～394.73 μm（（296.28 ± 67.38） μm）]；后吸器呈盤狀，無隔膜結(jié)構(gòu)，大小為[ 873.19～1 246.64 μm（（1 049.25 ± 144.62） μm） ]×[ 818.44～1 237.99 μm（（1 014.10 ± 164.83） μm）]；后吸器上具邊緣膜、附甲片、前鉤1對(duì)、后鉤1對(duì)以及邊緣小鉤數(shù)個(gè)。邊緣膜大小為 35～54.74 μm（（44.82 ± 7.28） μm）；附甲片大小為 168.58～227.91 μm（（201.12 ± 21.98） μm）；前鉤末端堅(jiān)硬鋒利，長(zhǎng) 244.09～347.4 μm（（301.05 ±46.78） μm）； 后 鉤 長(zhǎng) 53.78～ 116.56 μm（（90.49 ±30.53） μm）（表 1，圖 2）。

3.2 28S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序獲得IB蟲株28S rRNA序列長(zhǎng)度為394 bp（GenBank No. MN209942）。與 GenBank中同源序列的比對(duì)結(jié)果顯示，IB蟲株與其他本尼登蟲屬比對(duì)相似性在85.86%～99.47%之間。其中與鱾新本尼登蟲N. girellae isolate N1： MH843708.1，isolate IDW109-08：MH843694.1，isolate IDW04-12：MH843693.1 等相似性最高，達(dá)99.47%；與珻氏新本尼登蟲N. melleni：EU707805.1相似性為99.21%；與N. melleni isolate Zh-HGS20020517 相似性為98.91%；與Benedenia cf. seriolae FAS-2013 isolate SL93B5的相似性僅為85.86%。IB蟲株28S rRNA序列與其他同源序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示。

基于28S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，IB蟲株與其他鱾新本尼登蟲和珻氏新本尼登蟲聚為一簇，屬于新本尼登蟲屬。卡氏嗜鼻蟲（Nasicola klawei，HQ721184.1/ HQ721185.1/ HQ721186.1） 與 Capsala pricei（FJ971982.1）、Capsala laevis（FJ971979.1）聚為一簇，又與本尼登蟲屬種類聚類為一簇（圖4）。

表1 N. girellae isolate Batam與其他新本尼登蟲形態(tài)比較Table1 Comparison of morphological characters of N. girellae isolate Batam with other similar species

圖2 鱾新本尼登蟲光鏡觀察Fig.2 Morphology of Neobenedenia girellae isolate Batam

4 討論

長(zhǎng)期以來，形態(tài)學(xué)特征一直是系統(tǒng)發(fā)育及分類學(xué)研究的主要依據(jù)，而單殖吸蟲類的分類多采用傳統(tǒng)分類學(xué)方法，依賴肉眼和光學(xué)顯微鏡，通過對(duì)寄生蟲外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、寄生部位、流行性規(guī)律進(jìn)行觀察，從而進(jìn)行分類鑒定。1963年Yamaguti[17]將單殖吸蟲分室科分為5個(gè)亞科，其中本尼登亞科至今已通過研究鑒定到包括Allobenedenia、Neobenedenia、Pseudoentobdella等16屬共50余種。本研究中，對(duì)印度尼西亞峇淡海域養(yǎng)殖卵形鯧鲹體表分離得到的IB蟲株進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示其蟲體后吸盤不具分隔，具窄邊緣膜和3對(duì)形狀不一的中央大鉤。前列腺囊包裹于陰精囊內(nèi)，無陰道結(jié)構(gòu)，根據(jù)Yamaguti[17]及Whittington和Horton[7]的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，IB蟲株具有新本尼登蟲屬的特征。

圖3 鱾新本尼登蟲28S rRNA序列同源比對(duì)Fig.3 Homology comparison of 28S rRNA of Neobenedenia girellae isolate Batam

圖4 鱾新本尼登蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of Neobenedenia girellae isolate Batam

本研究中IB蟲株的各項(xiàng)形態(tài)特性與楊文川記錄的珻氏新本尼登蟲形態(tài)較為相似，但形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)卻存在一定的差異。已有研究表明寄生蟲的宿主種類、寄生蟲的年齡、寄生蟲樣本的處理方法均會(huì)對(duì)其蟲體大小、形態(tài)學(xué)特征有一定的影響。此外Whittington和Horton[7]的研究同樣證實(shí)了宿主的不同會(huì)導(dǎo)致相同種類蟲體外部形態(tài)存在一定的差異這一觀點(diǎn)。本研究在樣品保存及處理過程中發(fā)現(xiàn)，使用酒精及福爾馬林溶液固定的新本尼登蟲，會(huì)出現(xiàn)萎縮、褶皺等不同程度的變形。以上通過形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行分類鑒定所暴露出的問題顯示，僅僅依靠形態(tài)學(xué)的數(shù)據(jù)對(duì)新本尼登蟲進(jìn)行分類的結(jié)果將會(huì)存在諸多爭(zhēng)議。

事實(shí)上自1963年Yamaguti[17]建立新本尼登屬Neobenedenia開始，世界各地的新本尼登蟲報(bào)道繁多，但由于該屬的分類問題一直存在較大爭(zhēng)議，故存在大量同種異名的情況。其中最為典型的爭(zhēng)議就是N. girellae與N. melleni是否為同種異名品種。N. mel-leni最早在1927年由MacCallum首次發(fā)現(xiàn)并定名為Benedenia melleni。1963年Yamaguti建立新本尼登屬后，將B. melleni更名為N. melleni，并作為該屬的模式種。N. girellae由Hargis 1955年首次發(fā)現(xiàn)并定名為B.girellae，后由Yamaguti更名并移入新本尼登屬。Hargis[18]，Yamaguti[17]，Bondad-Reantaso 等[19]，Yoshinaga 等[8]研究觀察到 N. melleni相較于N. girellae蟲體更為寬短，N. girellae具有明顯的滕腺，且兩者后吸器鉤大小及形狀不同，認(rèn)為珻氏新本尼登蟲（N. melleni）和鱾新本尼登蟲（N. girellae）分別為兩個(gè)獨(dú)立的種。而Whittington等[10]則認(rèn)為兩者仍存在如睪丸邊緣缺刻，無陰道等共同的內(nèi)部形態(tài)特征，故認(rèn)為兩者為同種異名的品種。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行物種鑒定，遺傳演化及物種親緣關(guān)系的研究逐步增多。分子生物學(xué)技術(shù)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合，在解決寄生蟲系統(tǒng)分類以及某些疑難、易混淆種類的分類鑒定方面獲得了很大成功[9,20-21]。Gunningham等最早采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)鮭魚3種三代蟲的18s rRNA進(jìn)行分析研究，顯示不同蟲種18S rRNA基因的V4區(qū)域存在明顯差異，并以此設(shè)計(jì)出特異性探針來進(jìn)行不同蟲種的識(shí)別[22]。楊文川等[23]對(duì)鱾新本尼登蟲生活史中發(fā)育各期幼蟲的形態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)的觀察，描述和測(cè)量，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與Theo等描述的珻氏新本尼登蟲各期幼蟲特征非常相似，認(rèn)為其屬于同種異名。而張紋等[20]對(duì)于福建海區(qū)的鱾新本尼登蟲與珻氏新本尼登蟲28S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性高達(dá)99.7%，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于測(cè)定的珻氏新本尼登蟲種間相似度（99.41%），支持了兩者為同種異名品種的論點(diǎn)。

本研究針對(duì)印度尼西亞峇淡島海域分離得到的本尼登類寄生蟲28S rRNA進(jìn)行研究，并與GenBank中本尼登蟲及新本尼登蟲等親緣物種的同源基因進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化研究。序列比對(duì)的結(jié)果顯示本研究中的IB蟲株與其他本尼登蟲屬的種類相似性在85.86%～99.47%之間，其中與鱾新本尼登蟲類相似性最高，達(dá)99.47%；與珻氏新本尼登蟲類相似性次之，為99.21%。而系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，IB蟲株與其他鱾新本尼登蟲和珻新本尼登蟲聚為一簇，屬于新本尼登蟲屬?？ㄊ鲜缺窍x與Capsala pricei、C. laevis單為一簇，后又與本尼登蟲屬合為一簇，顯示IB蟲株與鱾新本尼登蟲和珻氏新本尼登蟲具有非常近的親緣關(guān)系，該結(jié)果同樣從分子生物學(xué)角度支持了Whittington等[10]的研究結(jié)果，即鱾新本尼登蟲（N. girellae）和珻新本尼登蟲（N. melleni）為同一種類的同種異名。