潘云霞，劉思琪，賀亞清，向 陽

（西南大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，重慶 400715）

0 引 言

將秸稈厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣是提高農(nóng)業(yè)廢棄物全量化和資源化利用的一種重要手段[1]。中國每年產(chǎn)生約10.4億t 秸稈，若將其進(jìn)行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，不僅可解決焚燒帶來的環(huán)境污染問題，還可緩解當(dāng)前日益嚴(yán)峻的能源短缺問題。秸稈由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素通過化學(xué)鍵相互交聯(lián)纏繞構(gòu)成，這種致密結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙秸稈與微生物的接觸[2]，致使秸稈的水解酸化成為整個(gè)厭氧發(fā)酵的限速步驟，為此，需對(duì)秸稈進(jìn)行物理、化學(xué)或生物預(yù)處理[3-8]。生物預(yù)處理因反應(yīng)條件溫和、能耗低、易操作、環(huán)境友好等，備受研究者的青睞。

在生物處理中，單一菌易受產(chǎn)物抑制和發(fā)酵環(huán)境影響，造成產(chǎn)氣不穩(wěn)定[9-10]，復(fù)合菌系由于菌群間良好的協(xié)同作用，能較好的克服這些問題[11-13]，黃開明等[11]利用復(fù)合菌HK-4 預(yù)處理玉米秸稈15 d，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)到64.52%、51.06%和3.89%，沼氣產(chǎn)量較未接菌的對(duì)照提高了27.4%；祝其麗等[12]利用復(fù)合菌AMC 預(yù)處理玉米秸稈3 d，沼氣產(chǎn)量增加了6.89%；Sameh 等[13]利用復(fù)合菌處理木屑，沼氣產(chǎn)量較對(duì)照提高86.4%。因此，利用復(fù)合菌對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行生物預(yù)處理，能有效提高厭氧發(fā)酵的沼氣產(chǎn)量。但復(fù)合菌種類多，分泌的水解酶會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵末端產(chǎn)物的多樣化。在厭氧發(fā)酵過程中，有70%～80%的甲烷來自于乙酸的轉(zhuǎn)化[14]，如果復(fù)合菌系能定向降解秸稈，使其轉(zhuǎn)化為易被產(chǎn)甲烷菌利用的底物，將對(duì)提高厭氧發(fā)酵中沼氣的品質(zhì)具有重要作用。為此，實(shí)驗(yàn)室從新疆多年連作的棉田土壤和牛糞、稻稈發(fā)酵液中，通過限制性培養(yǎng)篩選得到一株能高效降解稻稈的復(fù)合菌系，通過高通量測序，并結(jié)合宏基因組技術(shù)，對(duì)復(fù)合菌系高效降解稻稈產(chǎn)酸機(jī)制進(jìn)行研究，并將其用于半連續(xù)厭氧發(fā)酵，以提高稻稈厭氧發(fā)酵效率和沼氣的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合菌系是由本實(shí)驗(yàn)室從新疆多年連作的棉田和牛糞、稻稈發(fā)酵液中通過限制性培養(yǎng)方法篩選得到，使用前保存在-80℃冰箱。稻稈取自西南大學(xué)水稻研究所的試驗(yàn)田，將自然風(fēng)干稻稈在1%氫氧化鈉溶液中浸泡24 h，之后用自來水對(duì)浸泡稻稈反復(fù)沖洗，直至沖洗水的pH 值接近中性，將清洗后的稻稈置于80℃的鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥，之后剪成1 cm 的小段，存放在塑料袋中并置于干燥器中。蛋白胨纖維素培養(yǎng)基由蛋白胨5 g、NaCl 5 g、酵母提取物1 g 和CaCO32 g 構(gòu)成。

1.2 試驗(yàn)方法

在蛋白胨纖維素培養(yǎng)基中加入20 g 稻稈和1 000 mL去離子水，pH 值調(diào)節(jié)至9，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，接種3%的復(fù)合菌系，生物預(yù)處理稻稈3 d 產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸（Volatile Fatty Acid，VFAs）和乙醇，經(jīng)2 000 r/min 離心10 min，取上清液每天加入285.7 mL至2.5 L 厭氧發(fā)酵罐。厭氧發(fā)酵罐中接種體積比20%豬糞發(fā)酵沼液作為接種物，接種物中微生物通過16S rDNA 高通量測序，細(xì)菌以Clostridium、Terrisporobacter和Turicibacter為主，產(chǎn)甲烷菌以Methanosarcina和Methanobrevibacter為主。在預(yù)處理產(chǎn)酸階段，以單獨(dú)的蛋白胨纖維素培養(yǎng)基作為試驗(yàn)的對(duì)照組，記為CK，在厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷階段，以未添加復(fù)合菌的處理為對(duì)照組，記為CK，每組試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)裝置

稻稈生物預(yù)處理厭氧發(fā)酵裝置如圖1 所示。試驗(yàn)用1 L 的產(chǎn)酸發(fā)酵罐和2.5 L 的厭氧發(fā)酵罐，2 個(gè)發(fā)酵罐的瓶口都使用帶有玻璃導(dǎo)管的橡膠塞進(jìn)行密封，采用水浴加熱，自動(dòng)控制發(fā)酵溫度，進(jìn)行為期40 d 的中溫（35±1）℃厭氧發(fā)酵，用集氣袋收集氣體，酸化并離心好的料液，在蠕動(dòng)泵的作用下按照產(chǎn)甲烷相水力停留時(shí)間（Hydraulic Retention Time，HRT）7 d 定量輸送到厭氧發(fā)酵罐中產(chǎn)沼氣。

圖1 試驗(yàn)示意圖 Fig.1 Schematic diagram of the experiment

1.4 分析方法

測定稻稈降解率時(shí)采用濾網(wǎng)過濾產(chǎn)酸發(fā)酵液，將殘留物85 ℃烘干稱質(zhì)量，用減質(zhì)量法計(jì)算出稻稈降解率[8]，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定采用全自動(dòng)纖維素測定儀（ANKOM2000i），pH 值采用pH 計(jì)（PB-10）測定，sCOD 采用COD 測定儀（DR1010）測定，產(chǎn)氣量用排水法測定，甲烷含量和VFAs 濃度采用氣相色譜儀（GC-2030）進(jìn)行測定。稻稈組分、VFAs、pH 值和sCOD 每3 d 測定一次，產(chǎn)氣量和甲烷含量每天測定一次。

1.5 16S rDNA 高通量測序和宏基因組測序

將樣品10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物按照試劑盒（FastPrep? Kits）說明書進(jìn)行DNA提取，將檢測合格的DNA 樣品，選用細(xì)菌通用性引物 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，16S rDNA 高通量測序。同時(shí)，對(duì)第3 天的發(fā)酵樣品用E.Z.N.A.? Kits 試劑盒進(jìn)行DNA 抽提，通過Covaris M220將抽提到的DNA 進(jìn)行片段化，篩選其中約300 bp 的片段進(jìn)行PE 文庫的構(gòu)建和宏基因組測序。高通量測序和宏基因組測序數(shù)據(jù)均使用上海美吉生工云平臺(tái)進(jìn)行分析（https：//i-sanger.com）。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈對(duì)稻稈組分和VFAs、乙醇的影響

復(fù)合菌系預(yù)處理中，稻稈及其各組分的變化如圖2所示。由圖2a 可以看出，復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈的前3 d，稻稈的降解速度最快，在第3 天時(shí)，稻稈的降解率達(dá)到64.05%，纖維素和半纖維素的降解率分別達(dá)到61.02%和76.81%，最難降解的木質(zhì)素，降解率也達(dá)到了20.31%，這比宋亞彬等篩選的復(fù)合菌系BYND-8，在稻稈達(dá)到相似降解率時(shí)的時(shí)間縮短了4 d[15]，此時(shí)，由于復(fù)合菌系對(duì)稻稈的降解，其致密結(jié)構(gòu)被打破，稻稈的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)松軟、蓬松狀態(tài)，其烘干后的表觀狀態(tài)呈現(xiàn)出多于第1 天的情況（圖2b）；復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈6 d 后，纖維素和半纖維素降解速度減慢，稻稈的降解率也增加緩慢，到12 d時(shí)，大部分稻稈被復(fù)合菌系降解（圖2b），稻稈的降解率達(dá)到89.02%，是Wang 等篩選的復(fù)合菌系XDC-2 的2倍[16]，纖維素和半纖維素降解率分別達(dá)到80.51%和88.73%，木質(zhì)素的降解率也到達(dá)了62.68%，這表明復(fù)合菌系具有強(qiáng)大的木質(zhì)纖維素降解能力。

圖2 復(fù)合菌預(yù)處理稻稈時(shí)各組分的變化及降解效果 Fig.2 Components variation and degradation effect of rice straw bio-pretreated by microbial consortium

復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈2 d，由于VFAs含量增加，pH值由9.0迅速降至6.2，第5天后，由于VFAs中乙酸、丁酸和戊酸含量逐漸降低，加之培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的分解，使得pH值逐漸增加，在第7天達(dá)到7.5左右（圖3a）；而培養(yǎng)基中由于葡萄糖分解產(chǎn)生VFAs，使得pH值在前2 d由9.0降至7.0，隨后由于VFAs含量的降低和蛋白質(zhì)的分解，使得pH值在2 d后稍有增加，在第7天時(shí)達(dá)到8.0左右（圖3b），這意味著該復(fù)合菌系具有一定的pH值調(diào)節(jié)能力。

圖3 復(fù)合菌預(yù)處理稻稈時(shí)pH 值、VFAs（Volatile Fatty Acids）的變化 Fig.3 pH value, VFAs concentration of bio-pretreated rice by microbial consortium

圖3 a 顯示，復(fù)合菌預(yù)處理稻稈過程中，乙酸在第1天就處于較高濃度，達(dá)到1 779.3 mg/L，并在第3 天達(dá)到最高值2 278.36 mg/L，隨后乙酸含量雖稍有下降，但始終保持在較高的濃度（1 400 mg/L 以上），遠(yuǎn)高于對(duì)照組第2 天乙酸含量的最高值421.34 mg/L（圖3b）；丁酸和乙醇在稻稈生物預(yù)處理的初期，濃度都較低，隨著復(fù)合菌對(duì)稻稈預(yù)處理時(shí)間由1 d 增加到6 d，丁酸含量由423.76 mg/L 增加到1 485.89 mg/L，乙醇含量也由第1 天時(shí)的97.31 mg/L 增加到第5 天時(shí)的1 642.61 mg/L，隨后，這兩者的含量都開始逐漸降低，至第7 天時(shí)，丁酸和乙醇含量分別降至1 325.54 mg/L 和1 097.19 mg/L（圖3a），遠(yuǎn)高于對(duì)照組丁酸在第2 天的最高值166.19 mg/L 和乙醇第1 天的最高值15.60 mg/L（圖3b）。本研究篩選的復(fù)合菌系，其乙酸（2 278.36 mg/L）和丁酸含量（1 485.89 mg/L）遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)報(bào)道的乙酸（1.5 g/L）和丁酸（0.6 g/L）濃度[17]，而且，復(fù)合菌預(yù)處理稻稈7 d，乙酸含量占總VFAs 的54.51%，丁酸含量占總VFAs 的29.02%，而丙酸和戊酸在整個(gè)稻稈生物預(yù)處理階段都保持較低的含量，僅占VFAs 的12.89%和3.58%。這說明復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈是以乙酸和丁酸為主的丁酸型發(fā)酵。

2.2 復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈的菌群結(jié)構(gòu)及功能解析

由圖2 可知，復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈的前3 d，稻稈的降解速度最快，已被產(chǎn)甲烷菌利用的乙酸也在第3 天達(dá)到最高值，故選擇第1 天和第3 天的微生物菌群進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。圖4 顯示，復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈過程中，微生物在屬水平上第1 天和第3 天的優(yōu)勢菌屬差異不大，主要為Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等；但第1 天和第3 天，各菌屬的相對(duì)豐度差異極顯著（P<0.001）。

圖4 復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈第1 天和第3 天菌群在屬水平上的分類及顯著性分析（P<0.01） Fig.4 Classification and the significant difference analysis of 1d and 3d microbial consortium at genus level during rice straw bio-pretreated（P<0.01）

由于稻稈的主要成分為碳水化合物，通過物種（屬水平）與功能貢獻(xiàn)度分析發(fā)現(xiàn)，各菌屬都對(duì)碳代謝有最高的貢獻(xiàn)度，相對(duì)貢獻(xiàn)度均在45%以上，Lysinibacillus的相對(duì)貢獻(xiàn)度甚至達(dá)到了65.11%（圖5）。稻稈是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的復(fù)雜交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中，纖維素是由D-葡萄糖通過β-1，4 糖苷鍵鏈接而成的長鏈高分聚合物[18]，半纖維素是由幾種不同類型的單糖（葡萄糖、木糖、甘聚糖、阿拉伯糖與半乳糖等）構(gòu)成的異質(zhì)多聚體[19]。在復(fù)合菌中，相對(duì)豐度在前 3 位的Cellulosilyticum、Prevotella和Pseudomonas都對(duì)糖酵解有非常高的相對(duì)貢獻(xiàn)度，分別達(dá)到了25.91%、21.99%和17.65%，其中，Prevotella對(duì)果糖、甘露糖代謝有最大的相對(duì)貢獻(xiàn)度，達(dá)到20.90%，而Cellulosilyticum對(duì)戊糖轉(zhuǎn)化具有最大的貢獻(xiàn)度，達(dá)到了11.98%（圖5），這意味著Cellulosilyticum和Prevotella都對(duì)纖維素和半纖維素有非常強(qiáng)的代謝能力。有研究表明，Cellulosilyticum和Prevotella可以將纖維素、纖維二糖、木聚糖和葡萄糖等降解轉(zhuǎn)化為以甲酸、乙酸為主的代謝產(chǎn)物[20-22]，而復(fù)合菌系中相對(duì)豐度前10 位的Mobilitalea、Clostridium和Ruminococcaceae，也能將纖維素、半纖維素和纖維二糖轉(zhuǎn)化為以乙酸、乙醇、丁酸等為主的代謝產(chǎn)物[23-24]，這使得本復(fù)合菌系在生物預(yù)處理稻稈初期，乙酸和丁酸就達(dá)到較高的濃度。木質(zhì)素是復(fù)雜的芳香族多聚物，它通常是稻稈中最不易降解的組分。在復(fù)合菌相對(duì)豐度前三位的菌屬中，Pseudomonas對(duì)芳香族化合物的降解有最大的相對(duì)貢獻(xiàn)度，達(dá)到7.5%（圖5），這使得本復(fù)合菌系在生物預(yù)處理稻稈初期，就對(duì)稻稈有非常強(qiáng)的降解能力。

圖5 復(fù)合菌系的物種和功能貢獻(xiàn)度分析 Fig.5 Species and functional contribution analysis of microbial consortium

2.3 復(fù)合菌系預(yù)處理對(duì)稻稈厭氧發(fā)酵的影響

復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈中，第3 天的乙酸含量最高，由于厭氧發(fā)酵中，70%～80%的甲烷來自于乙酸的轉(zhuǎn)化[13]，所以將稻稈生物預(yù)處理第3 天的酸液通過半連續(xù)方式進(jìn)行厭氧發(fā)酵，結(jié)果如圖6 和圖7。由圖6 可知，在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中，試驗(yàn)組的sCOD 和VFAs 濃度都遠(yuǎn)高于對(duì)照。由于厭氧微生物需適應(yīng)接種的發(fā)酵環(huán)境，這使得sCOD、VFAs 和乙酸的含量在發(fā)酵的前幾天都在逐漸增加，試驗(yàn)組VFAs 和乙酸濃度在第6 天達(dá)到穩(wěn)定，sCOD在第15 天達(dá)到穩(wěn)定，而對(duì)照組的sCOD、VFAs 和乙酸含量均在第15 天達(dá)到穩(wěn)定。無論試驗(yàn)組還是對(duì)照，在整個(gè)40 d 的厭氧發(fā)酵中，丙酸、丁酸和戊酸的濃度幾乎保持不變。 屬Geobacter，但Methanosarcina 或Methanosarcina 有可能和其他菌互營降解乙醇和丁酸產(chǎn)甲烷，這使得厭氧發(fā)酵在進(jìn)入穩(wěn)定期后，雖然試驗(yàn)組和對(duì)照組的日產(chǎn)氣量相差不大，但試驗(yàn)組的甲烷含量和日甲烷產(chǎn)量都高于對(duì)照組。在第40 天的厭氧發(fā)酵中，試驗(yàn)組的日甲烷產(chǎn)量始終保持在200 mL/d 左右，日產(chǎn)氣量、甲烷含量和日甲烷產(chǎn)量較對(duì)照分別增加了11.34%、25.24%和34.10%。

圖6 厭氧發(fā)酵中的VFAs 和sCOD 濃度變化 Fig.6 Variation of VFAs and sCOD concentration in anaerobic fermentation

圖7 厭氧發(fā)酵中的日產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和甲烷含量 Fig.7 Daily biogas yield, methane yield and methane content in anaerobic fermentation

由于乙酸是產(chǎn)甲烷菌最易利用的底物，這使得厭氧發(fā)酵初期，試驗(yàn)組的日產(chǎn)氣量、甲烷含量和日甲烷產(chǎn)量就遠(yuǎn)高于對(duì)照，厭氧發(fā)酵前6 d，試驗(yàn)組的平均日產(chǎn)氣量、甲烷含量和日甲烷產(chǎn)量分別較對(duì)照組增加了17.7%、68.9%和72.58%。在厭氧發(fā)酵中，始終未檢測到產(chǎn)酸階段出現(xiàn)的乙醇，根據(jù)Rotaru 等的研究，甲烷八疊球菌Methanosarcina barkeri可與G. metallireducens通過直接種間電子轉(zhuǎn)移（Direct Interspecies Electron Transfer，DIET）互營降解乙醇產(chǎn)甲烷[25]，而且，乙醇也能促進(jìn)地桿菌屬Geobacter和甲烷絲菌屬M(fèi)ethanosaeta或甲烷八疊球菌屬M(fèi)ethanosarcina對(duì)丙酸和丁酸的互營降解[26]，在厭氧發(fā)酵中，丁酸含量由產(chǎn)酸階段第3 天的862.02 mg/L降至厭氧發(fā)酵階段的250 mg/L 左右，雖然在復(fù)合菌系和厭氧發(fā)酵接種物中均未發(fā)現(xiàn)G. metallireducens和地桿菌

3 結(jié) 論

1）復(fù)合菌系對(duì)稻稈進(jìn)行預(yù)處理，稻稈的降解主要發(fā)生在前3 d，其降解率達(dá)到64.05%。復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈12 d，稻稈的降解率達(dá)到89.02%，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解率分別達(dá)到88.73%、80.51%和62.68%。

2）復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈的代謝產(chǎn)物以乙酸和丁酸為主，乙酸和丁酸含量分別占總VFAs 的54.51%和29.02%，最高乙酸和丁酸含量分別達(dá)到 2 278.36 mg/L 和1 485.89 mg/L。

3）復(fù)合菌系主要由Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等組成，它們對(duì)碳代謝的相對(duì)貢獻(xiàn)度均在45%以上，其中，Prevotella和Cellulosilyticum對(duì)果糖、甘露糖代謝和戊糖轉(zhuǎn)化的相對(duì)貢獻(xiàn)度最大，達(dá)到20.90%和11.98%，Pseudomonas對(duì)木質(zhì)素降解的相對(duì)貢獻(xiàn)度最大，達(dá)到7.5%。

4）復(fù)合菌系預(yù)處理稻稈半連續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣，日產(chǎn)氣量、甲烷含量和日甲烷產(chǎn)量分別較對(duì)照增加11.34%、25.24%和 34.10%，日甲烷產(chǎn)量始終保持在200 mL/d 左右。