沈洋，呂雪芹，林璐, ，李江華，堵國(guó)成，劉龍*

1(未來(lái)食品科技中心，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(糖化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫，214122)

α-熊果苷(4-氫醌-α-D-吡喃葡萄糖苷)是一種天然糖苷，包含1個(gè)葡萄糖基和1個(gè)酚基，之間通過(guò)α-1,4糖苷鍵相連[1-2]。近年來(lái)，由于α-熊果苷有良好的對(duì)光輻射的耐褐變性和對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，因此在化妝品工業(yè)中被廣泛用作美白劑[3-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)羥苯甲酸酯1-羥化酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，從頭合成α-熊果苷，通過(guò)優(yōu)化葡萄糖濃度，α-熊果苷的產(chǎn)量達(dá)到4.19 g/L[5]。LIU等[6]通過(guò)一系列突變方法，篩選了具有高α-端基選擇性糖基化活性的突變型黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia)BT-112，利用該突變菌株生產(chǎn)α-熊果苷的產(chǎn)量為30.6 g/L。目前，利用酶的轉(zhuǎn)糖基化作用，以蔗糖為糖基供體、對(duì)苯二酚為糖基受體進(jìn)行酶法催化是制備α-熊果苷的主要方法[7-8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，糖基轉(zhuǎn)移酶[9]主要包括淀粉蔗糖酶(ASase，EC 2.4.1.4)[10-13]、蔗糖磷酸化酶(SPase，EC 2.4.1.7)[7, 14]和環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)[15-16]。例如，在來(lái)自野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv)的淀粉蔗糖酶的催化反應(yīng)下，α-熊果苷的產(chǎn)量高達(dá)61.7 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為94.5%[17]。另外，由于蔗糖磷酸化酶的高轉(zhuǎn)糖基能力[18]，且作用底物是廉價(jià)且容易獲得的蔗糖，因此常被選作生產(chǎn)α-熊果苷。來(lái)自腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的蔗糖磷酸化酶，可以催化蔗糖的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)生成α-熊果苷，摩爾轉(zhuǎn)化率為65%[19]。

蔗糖磷酸化酶是一種同型二聚體的細(xì)胞內(nèi)酶，屬于糖基水解酶13家族[20-21]。蔗糖磷酸化酶可在一步反應(yīng)中將蔗糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的糖基化產(chǎn)物[22]，即將蔗糖的糖基轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)受體上，形成相應(yīng)的產(chǎn)物。KITAO等[23]研究表明，蔗糖磷酸化酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖為糖基供體，多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等多類物質(zhì)均可以作為該酶的糖基受體。蔗糖磷酸化酶由于其廣泛的受體特異性，因而在高效生產(chǎn)α-熊果苷方面具有很大的潛力。迄今為止，在許多細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了蔗糖磷酸化酶的存在，包括青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)[24]，變異鏈球菌(Streptococcusmutans)[25]和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)[23]等，這些蔗糖磷酸化酶的基因已被克隆并異源表達(dá)。AERTS等[26]比較了6種不同來(lái)源的蔗糖磷酸化酶在體積分?jǐn)?shù)25%二甲基亞砜溶劑中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)來(lái)自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)和青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)的酶最穩(wěn)定。

本文選用來(lái)源于StreptococcusmutansUA159的蔗糖磷酸化酶(SmSP)在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，采用更換表達(dá)載體、定點(diǎn)飽和突變和優(yōu)化反應(yīng)條件的方式，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷。經(jīng)過(guò)以上幾種策略，我們獲得催化效率較高的重組菌株B.subtilisWB600/pP43NMK-P43-SmSPI336L,α-熊果苷的產(chǎn)量達(dá)到了110.3 g/L,HQ摩爾轉(zhuǎn)化率為88.7%，相比原始菌株(40.2 g/L)，產(chǎn)量提高了2.74倍。

1 材料與方法

1.1 菌株-質(zhì)粒與試劑

表達(dá)SmSP蛋白的gtfA基因(GeneBank登錄號(hào)NC_004350.2)由天霖生物技術(shù)公司合成，并對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化?？寺∷拗鞔竽c桿菌EscherichiacoliJM109 (E.coliJM109)、異源表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600(B.subtilisWB600，BSWB600)和表達(dá)載體pP43NMK、pHT01、pMA0911.1和pSTOP1622均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

α-熊果苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自Sigma-Aldrich，對(duì)苯二酚(hydroquinone, HQ)和相關(guān)化合物購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(中國(guó)上海)，ClonExpress II一步克隆試劑盒購(gòu)自諾維贊(中國(guó)南京)，Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素均購(gòu)自上海生工。其他常用試劑均為分析純。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pUC19-gtfA為模板PCR擴(kuò)增經(jīng)密碼子優(yōu)化的gtfA基因。通過(guò)酶切連接的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT01-Pgrac100-gtfA和pMA0911.1-PHpaII-gtfA，運(yùn)用一步克隆的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒pP43NMK-P43-gtfA和pSTOP1622-PxylA-gtfA。所用引物如表1所示。

表1 本文使用的引物

1.3 異源表達(dá)和生物轉(zhuǎn)化

將帶有工程質(zhì)粒的大腸桿菌E.coliJM109在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl)中，37 ℃培養(yǎng)，并添加相應(yīng)的抗生素。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞中，單菌落在含有相應(yīng)抗生素的20 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)10 h。然后，將種子培養(yǎng)基以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至Terrific-Broth(TB)發(fā)酵培養(yǎng)基(12 g/L蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5.04 g/L甘油、17 mmol/L KH2PO4和72 mmol/L K2HPO4)中，37 ℃培養(yǎng)12 h。對(duì)于帶有不同質(zhì)粒的重組B.subtilisWB600，抗生素的終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素、30 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL氯霉素和100 μg/mL氨芐青霉素。

為了制備全細(xì)胞生物催化劑，離心收集發(fā)酵結(jié)束的菌體，用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(PB緩沖液，pH 7.0)洗滌2次。在含有40 g/L HQ、372 g/L蔗糖、20 mmol/L PB緩沖液的反應(yīng)混合物中進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在50 mL密閉容器中，30 ℃振蕩反應(yīng)20 h，用高效液相色譜檢測(cè)上清液中的α-熊果苷濃度。

1.4 高效液相色譜(HPLC)分析產(chǎn)物

使用配備紫外檢測(cè)器(281 nm)的Agilent SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)通過(guò)高效液相色譜法(HPLC，Agilent 1200)測(cè)量上清液中的α-熊果苷濃度。流動(dòng)相為10 mmol/L的稀H3PO4和甲醇(體積比為8∶2)，流速0.6 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.5 定點(diǎn)飽和突變

我們根據(jù)預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn)來(lái)選擇SmSP的氨基酸殘基，并對(duì)所選擇的位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，以提高SmSP的催化效率。以pP43NMK-P43-gtfA為模板，使用一步PCR法替換編碼特定氨基酸的3個(gè)堿基，引物在表1中給出。擴(kuò)增的樣品用DpnI在37 ℃，2 h消化模板DNA，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和生物轉(zhuǎn)化。

1.6 突變體活性與蛋白濃度的測(cè)定

以HQ作為底物，采用HPLC法測(cè)定α-熊果苷的濃度以測(cè)定酶活力。反應(yīng)底物為182 mmol/L HQ和200 mmol/L蔗糖，溶劑為pH 7.0的PB緩沖液，將待測(cè)酶液與反應(yīng)底物溶液均置于30 ℃預(yù)熱5 min。取干凈并于30 ℃預(yù)熱過(guò)的1.5 mL離心管，加入800 μL反應(yīng)底物溶液，再加入200 μL待測(cè)酶液，總反應(yīng)體系為1 mL，于30 ℃水浴反應(yīng)5 min，精確計(jì)時(shí)，100 ℃水浴加熱10 min終止反應(yīng)。利用HPLC法檢測(cè)α-熊果苷的濃度。以失活后的酶液為反應(yīng)空白對(duì)照。1個(gè)單位的蔗糖磷酸化酶酶活力定義為：在30 ℃，pH 7.0的條件下，1 h能轉(zhuǎn)化1 μmol底物HQ為1 μmol產(chǎn)物α-熊果苷的酶量，即1 U=1 μmol/h。使用Bradford蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定酶液中的蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

1.7 突變體的純化

用一步PCR的方法，在酶蛋白C-端添加6-His標(biāo)簽，以便對(duì)蛋白進(jìn)行親和層析。一步PCR所用引物在表1中給出。收集成功表達(dá)酶蛋白的菌體細(xì)胞，用20 mmol/L的PB緩沖液(pH 7.0)洗滌細(xì)胞2次，并用該緩沖液重懸細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞重懸液進(jìn)行超聲破碎，直至細(xì)胞重懸液呈現(xiàn)澄清的狀態(tài)，以10 000 r/min低溫高速離心30 min，棄除沉淀，所得上清液用孔徑0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，制備蛋白的親和層析。將過(guò)濾所得粗酶液通過(guò)鎳柱(His GraviTrap柱)，利用AKTA蛋白純化儀進(jìn)行純化。上樣后，用緩沖液A(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.0)平衡柱子，流速為1 mL/min。然后用緩沖液B(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、300 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 7.0)按照10%～100%進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，純化后的酶液保存在4 ℃條件下備用。純化的蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.8 突變體酶學(xué)性質(zhì)研究

為測(cè)定溫度對(duì)突變體酶活性的影響，根據(jù)1.7中突變體酶活力的測(cè)定方法，測(cè)定在25～45 ℃溫度下，突變體的酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。為測(cè)定pH對(duì)突變體酶活力的影響，根據(jù)1.7中突變體酶活力的測(cè)定方法，選擇pH 6.0～10.0的緩沖液測(cè)定突變體的最適反應(yīng)pH。使用的緩沖液如下：磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～8.0)，NaHCO3-NaOH緩沖液(pH 9.0～10)，緩沖液濃度均為20 mmol/L。

以不同濃度的對(duì)苯二酚(濃度范圍：0.9～136 mmol/L)為底物，測(cè)定突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)公式(1)利用雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行作圖，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)：

(1)

式中：V，反應(yīng)速率，μmol/(L·min)；Km，米氏常數(shù)，mmol/L；[S]，底物濃度，mmol/L；Vmax,最大反應(yīng)速率，μmol/(L·min)。

1.9 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

為研究收集菌體的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，根據(jù)1.3方法，分別離心收集發(fā)酵培養(yǎng)8、12、16、20、24 h的菌體，對(duì)發(fā)酵不同時(shí)間的菌體進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。

為研究菌體添加量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，根據(jù)1.3方法，添加不同量的菌體使全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的OD600值分別為10、20、30、40、50、60、90和100。

為研究表面活性劑的添加對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，根據(jù)1.3方法，在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中，分別添加體積分?jǐn)?shù)為0.2%、2%、5%和8%的Tween-80，體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%和2%的Triton X-100。

2 結(jié)果與討論

2.1 SmSP的表達(dá)和表達(dá)載體的優(yōu)化

為了在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)SmSP的異源表達(dá)，我們首先將gtfA基因PCR擴(kuò)增并構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pHT01-Pgrac100-gtfA(圖1-a)。通過(guò)SDS-PAGE分析以確認(rèn)SmSP是否成功表達(dá)。如圖1-b所示，在49 kDa處發(fā)現(xiàn)目標(biāo)條帶，這表明SmSP在枯草芽孢桿菌中已經(jīng)成功表達(dá)。

為了提高SmSP的表達(dá)水平，我們又構(gòu)建3個(gè)重組表達(dá)載體：pMA0911.1-PHpaII-gtfA、pSTOP1622-PxylA-gtfA和pP43NMK-P43-gtfA，如圖1-a所示。本文所用的4種質(zhì)粒分別含有不同的拷貝數(shù)，pP43NMK屬于高拷貝質(zhì)粒，pMA0911.1和pSTOP1622屬于中拷貝質(zhì)粒，而pHT01屬于低拷貝數(shù)質(zhì)粒。此外，這些質(zhì)粒包含不同的啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子(PHpaII，P43)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Pgrac100，PxylA)。P43是枯草芽孢桿菌中的強(qiáng)啟動(dòng)子，并且可以在不同的生長(zhǎng)條件下都可以保持較高的啟動(dòng)子活性。我們通過(guò)SDS-PAGE分析SmSP在不同重組菌株中的表達(dá)情況，如圖1-b所示，4個(gè)重組菌株的細(xì)胞破碎上清液中均能觀察到清晰的目標(biāo)蛋白條帶。與pHT01-Pgrac100-gtfA相比，重組質(zhì)粒pP43NMK-P43-gtfA產(chǎn)生的蛋白條帶更粗，即SmSP的蛋白表達(dá)量更高，而含有pMA0911.1-PHpaII-gtfA和pSTOP1622-PxylA-gtfA的重組菌株所產(chǎn)生的條帶粗細(xì)相似(圖1-b)。接下來(lái)，我們使用構(gòu)建的4株重組菌株進(jìn)行了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，用α-熊果苷的產(chǎn)量來(lái)驗(yàn)證不同載體表達(dá)SmSP的能力。結(jié)果如圖1-c所示，含質(zhì)粒pP43NMK-P43-gtfA的重組菌株產(chǎn)生的α-熊果苷的產(chǎn)量高于其他3種重組菌株。并且，這4株重組菌株均在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化20 h時(shí)達(dá)到最高的α-熊果苷產(chǎn)量，其中含有重組質(zhì)粒pP43NMK-P43-gtfA的重組菌株在20 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到40.2 g/L。

眾所周知，基因拷貝數(shù)是影響基因表達(dá)水平的重要參數(shù)[27]?；蚩截悢?shù)的高低，可直接影響到目的蛋白表達(dá)量的高低。另外，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的另一個(gè)高效策略之一是構(gòu)建具有高活性和可控啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)[28-29]。根據(jù)液相結(jié)果(圖1-c)，在所選擇的4種質(zhì)粒中，用包含有P43啟動(dòng)子的pP43NMK質(zhì)粒來(lái)表達(dá)SmSP效果最好。綜上所述，高拷貝數(shù)對(duì)于SmSP的表達(dá)是有益的，而啟動(dòng)子是直接影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平的重要調(diào)控元件。

a-4個(gè)重組表達(dá)載體的構(gòu)建;b-重組菌株的細(xì)胞破碎后上清液的SDS-PAGE分析；M-Marker；1-5分別表示BSWB600/pP43NMK，BSWB600/pHT01-Pgrac100-gtfA，BSWB600/pMA0911.1-PHpaII-gtfA，BSWB600/pSTOP1622-PxylA-gtfA和BSWB600/pP43NMK-P43-gtfA;c-催化不同時(shí)間重組菌株BSWB600/pHT01-Pgrac100-gtfA，BSWB600/pMA0911.1-PHpaII-gtfA，BSWB600/pSTOP1622-PxylA-gtfA和BSWB600/pP43NMK-P43-gtfA產(chǎn)α-熊果苷的產(chǎn)量

2.2 SmSP中l(wèi)oop A的定點(diǎn)飽和突變

根據(jù)SWISS-MODEL網(wǎng)站的預(yù)測(cè)，來(lái)自青春雙歧桿菌B.adolescentis的蔗糖磷酸化酶BaSP(PDB ID：2gdv)與SmSP具有43.74%的氨基酸序列同一性，因此選擇BaSP的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)SmSP的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模。該結(jié)構(gòu)由2個(gè)同源亞基組成，在結(jié)構(gòu)上與BaSP類似，SmSP可以分為4個(gè)域：A、B、B′和C。結(jié)構(gòu)域B由2個(gè)短的反平行β-折疊和2個(gè)短的α-螺旋組成，其結(jié)構(gòu)域中還有1個(gè)控制受體底物結(jié)合的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)loop A(329AEYNNLDIY337)。結(jié)構(gòu)域B′由一長(zhǎng)一短2個(gè)α-螺旋組成，其中包含1個(gè)柔性環(huán)結(jié)構(gòu)loop B(132YKRKD136)。結(jié)構(gòu)域C是由SmSP的前56個(gè)殘基形成的5個(gè)反平行β-折疊組成。有文獻(xiàn)報(bào)道，BaSP中的受體結(jié)合位點(diǎn)由結(jié)構(gòu)域B和B′決定[30]，并且柔性環(huán)loop A和loop B對(duì)于受體結(jié)合的特異性至關(guān)重要，這2個(gè)柔性環(huán)覆蓋了催化腔并隨后協(xié)助特定底物結(jié)合與催化[31-33]。

因此，在本研究中，將受體亞位點(diǎn)Ile336選作突變位點(diǎn)。Ile336的定點(diǎn)飽和突變結(jié)果如圖2所示，與野生型酶SmSP(WT)相比，突變體SmSPI336L(Ile336突變?yōu)長(zhǎng)eu336)表現(xiàn)出更好的催化活性，α-熊果苷的產(chǎn)量為71.7 g/L。一些突變體突變體的α-熊果苷產(chǎn)量略低于原始菌株(49.8 g/L)：SmSPI336N(47.7 g/L)、SmSPI336Q(46.3 g/L)和SmSPI336E(40.6 g/L)。還有一些突變體的催化能力很低，如突變體SmSPI336C和SmSPI336S幾乎無(wú)產(chǎn)量。

圖2 不同突變體的α-熊果苷的產(chǎn)量

為了進(jìn)一步研究突變體SmSPI336L的催化能力比SmSP提高的原因，運(yùn)用Discovery Studio 2017軟件，將酶蛋白(SmSP和SmSPI336L)分別與受體底物HQ進(jìn)行分子對(duì)接。然后使用DS軟件將該對(duì)接結(jié)果繪制成三維圖像，如圖3-a所示。根據(jù)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析，圖3-b和圖3-c分別是SmSP和突變體SmSPI336L與底物HQ分子對(duì)接的結(jié)果。氨基酸殘基Ile336均不直接和底物HQ結(jié)合，對(duì)于野生型SmSP來(lái)說(shuō)(圖3-b)，HQ是通過(guò)4個(gè)極性鍵與loop B中的Asp136以及l(fā)oop A中的Asn333相結(jié)合。與SmSP相比，SmSPI336L與HQ形成了2個(gè)新的極性鍵[Thr328 (loop A)/HQ; Tyr331 (loop A)/HQ](圖3-c)，這表明突變體SmSPI336L的活性位點(diǎn)對(duì)HQ的親和力增強(qiáng)了[34]。此外，野生型酶SmSP中活性位點(diǎn)殘基與HQ結(jié)合的平均鍵長(zhǎng)為2.775 埃，而突變體SmSPI336L中的活性位點(diǎn)殘基與HQ結(jié)合的平均鍵長(zhǎng)縮短為2.475 埃。綜合以上分子對(duì)接的結(jié)果表明，與野生型酶相比，突變體SmSPI336L與受體底物HQ之間的相互作用更加穩(wěn)定，即更易于捕獲到HQ，有利于轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的進(jìn)行。

a-SmSP與HQ分子對(duì)接;b-SmSP與HQ分子對(duì)接結(jié)果;c-SmSPI336L與HQ分子對(duì)接結(jié)果

有報(bào)道，Arg135和Tyr344是BaSP受體結(jié)合位點(diǎn)中與特定底物結(jié)合的最重要的氨基酸殘基[35]。位于Asp342和Tyr344之間的氨基酸對(duì)受體底物的結(jié)合也有著不可忽略的影響，因?yàn)槠淇梢允谷嵝原h(huán)形成一個(gè)特定的構(gòu)象，從而促進(jìn)酶與底物的結(jié)合[31]。對(duì)于BaSP，氨基酸殘基Leu343是使相鄰受體結(jié)合殘基Tyr344正確定位所必需的[31]。當(dāng)loop A在不同構(gòu)象之間切換時(shí)，Leu343側(cè)鏈的移動(dòng)，導(dǎo)致Tyr344被推入催化活性位點(diǎn)并與受體底物相互作用。結(jié)合本文的研究結(jié)果，對(duì)于SmSP的第336位氨基酸也有使相應(yīng)的氨基酸殘基正確定位，并促使與底物結(jié)合的作用。明確了loop A是構(gòu)成轉(zhuǎn)糖基作用的另一個(gè)關(guān)鍵活性位點(diǎn)，也說(shuō)明了SmSP中的第336位氨基酸殘基的正確構(gòu)象，對(duì)于與受體底物的結(jié)合和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)至關(guān)重要。

2.3 突變體的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

為了進(jìn)一步研究SmSP的酶學(xué)性質(zhì)，將SmSP和SmSPI336L進(jìn)行了鎳柱純化。純化前及純化后的蛋白電泳如圖4所示。條帶1和2分別為SmSP和SmSPI336L的細(xì)胞破碎后的上清液，目的蛋白位于49 kDa位置處，條帶清晰，但含有大量的雜蛋白。條帶3和4分別為SmSP和突變體SmSPI336L經(jīng)過(guò)鎳柱純化后的蛋白條帶，在49 kDa位置處，目的蛋白條帶更粗且無(wú)雜蛋白。

a-純化前SDS-PAGE結(jié)果;b-純化后SDS-PAGE結(jié)果

檢測(cè)突變體的酶活力，由圖5可知，突變體SmSPI336L(I336L)的最適溫度和最適pH與對(duì)照(WT)相比，沒有明顯差異。最適溫度均為30 ℃，最適pH值均為7.0。為了驗(yàn)證在相同條件下，突變體SmSPI336L對(duì)受體底物HQ的親和力是否比對(duì)照強(qiáng)，本研究以HQ作為底物，對(duì)SmSP和SmSPI336L的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和kcat)進(jìn)行測(cè)定及分析。運(yùn)用雙倒數(shù)作圖法，得出的擬合直線如圖6所示。

a-溫度對(duì)酶活性影響；b-pH對(duì)酶活性影響

a-WT；b-I336L

根據(jù)擬合直線方程，對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果如表2所示。動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，突變體SmSPI336L的Km值降低，說(shuō)明突變體對(duì)底物HQ的親和力增加；催化常數(shù)kcat升高，催化效率kcat/Km相比對(duì)照提高了1.54倍。

表2 突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 全細(xì)胞催化合成α-熊果苷反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 收集發(fā)酵菌體的時(shí)間優(yōu)化

為探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的影響，分別收集發(fā)酵8、12、16、20、24 h的重組菌B.subtilisWB600/pP43NMK-P43-SmSPI336L進(jìn)行全細(xì)胞催化，用HPLC檢測(cè)α-熊果苷的產(chǎn)量，如圖7-a所示，收集發(fā)酵了12 h的菌體進(jìn)行全細(xì)胞催化，所得到的α-熊果苷產(chǎn)量最高，為74.7 g/L。結(jié)合B.subtilisWB600/pP43NMK-P43-SmSPI336L的菌體生長(zhǎng)曲線(圖7-b)可知，發(fā)酵12 h左右的菌體處于穩(wěn)定期，之后從15 h開始，便很快進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵12 h處于菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期，此時(shí)的菌體生物活性特征最好。因此收集發(fā)酵12 h的菌體進(jìn)行全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)，能夠獲得生長(zhǎng)狀態(tài)最好的菌體，從而獲得較高的α-熊果苷產(chǎn)量。

a-α熊果苷產(chǎn)量；b-OD600

2.4.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化菌體添加量的優(yōu)化

全細(xì)胞催化過(guò)程的實(shí)質(zhì)是胞內(nèi)酶的催化過(guò)程，而不同的菌體添加量(OD600)代表不同的添加酶量。合適的菌體添加量既能保證α-熊果苷有較高的產(chǎn)量，又不會(huì)對(duì)反應(yīng)底物和過(guò)量菌體造成浪費(fèi)。如圖8所示，當(dāng)菌體OD600為40時(shí)，全細(xì)胞催化反應(yīng)生成的α-熊果苷產(chǎn)量最高，為95.2 g/L，相比之前OD600為20的對(duì)照組，產(chǎn)量提高了29.7%，此時(shí)HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率為76.6%。當(dāng)菌體添加量再增加，α-熊果苷的產(chǎn)量降低，可能是菌體濃度過(guò)高，導(dǎo)致全細(xì)胞催化體系變得黏稠，不利于底物的接觸和催化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖8 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化菌體添加量的優(yōu)化

2.4.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中表面活性劑的優(yōu)化

對(duì)于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的底物分子HQ和蔗糖，細(xì)胞膜對(duì)底物分子的滲透能力是影響物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的重要因素。因此在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中添加不同濃度的表面活性劑，利用HPLC檢測(cè)α-熊果苷的產(chǎn)量。當(dāng)添加的表面活性劑為Tween-80時(shí)，α-熊果苷的產(chǎn)量沒有得到明顯的提高，如圖9-a所示，當(dāng)添加的表面活性劑為Triton X-100時(shí)，如圖9-b所示，添加體積分?jǐn)?shù)為1% Triton X-100時(shí)，α-熊果苷的產(chǎn)量提高至110.3 g/L，相比對(duì)照提高了15.6%。Triton X-100屬于非離子表面活性劑，能部分溶解細(xì)胞膜，相比于其他活性劑能更好地保證細(xì)胞膜的完整性，對(duì)細(xì)胞毒性小。

a-Tween-80添加體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-熊果苷的產(chǎn)量影響；b-Triton X-100添加體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-熊果苷的產(chǎn)量影響

3 結(jié)論

將變異鏈球菌StreptococcusmutansUA159中克隆得到的蔗糖磷酸化酶(SmSP)，在枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600中成功地異源表達(dá)。篩選出了表達(dá)SmSP的最佳載體pP43NMK-P43，通過(guò)定點(diǎn)飽和突變的方式，獲得了轉(zhuǎn)糖基效率較高的突變體SmSPI336L，并對(duì)獲得的重組菌株B.subtilisWB600/ pP43NMK-P43-SmSPI336L全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終α-熊果苷的產(chǎn)量達(dá)到了110.3 g/L，HQ摩爾轉(zhuǎn)化率為88.7%。與已報(bào)道的α-熊果苷生產(chǎn)方法相比，利用該法生產(chǎn)α-熊果苷的產(chǎn)量高，方法簡(jiǎn)單。對(duì)蔗糖磷酸化酶loop A區(qū)域的突變，為提高該酶與糖基受體底物的結(jié)合能力提供了新策略，也為利用蔗糖磷酸化酶高效生物轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷奠定了基礎(chǔ)。