李小燕，陳文波，鐘 鳴，李 慧，強婉麗，張連慧，張晨悅，盧 玉

（中糧營養(yǎng)健康研究院，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

三白瓜，原名三白西瓜（Citrullus lanatuscv.Sanbai (Citrullus lanatus(Tunb.) Matsum & Nakai cv.Sanbai)）是中國栽培歷史悠久的一種瓜果，屬于被子植物亞門、雙子葉植物綱、葫蘆目、葫蘆科、西瓜屬[1-3]。它因白皮、白瓤、白籽而得名“三白瓜”。三白瓜含有豐富的礦物質(zhì)和多種維生素，成熟果實除含有大量水分外，瓢肉含糖量一般為5%～12%，包括葡萄糖、果糖和蔗糖。歷史資料顯示，三白瓜始種于西漢，曾被定為明清兩代貢品[3-4]。目前，三白瓜的種植地主要分布在中國河北省威縣、山西省萬榮縣一帶，是當(dāng)?shù)鼐用裣哪┣锍醯闹饕?/p>

古醫(yī)書記載：三白瓜瓤亦稱“白虎湯”，能除暑熱，治血痢，解酒毒，治口瘡；其皮曰“翠衣”，亦有生津解煩之奇效；其籽甘寒，清肺潤腸，補中宜人，主治腸痛[3]。在中醫(yī)學(xué)上瓜汁和瓜皮都能入藥。作為地方特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，三白瓜因具有敗火清熱解毒的功效得到當(dāng)?shù)乩习傩盏恼J(rèn)可。另外，三白瓜具有其他西瓜品種無法超越的耐貯性能，最長可以存貯到第二年的清明[4]。此時，三白瓜甜度會因雙糖水解為單糖而降低，內(nèi)部為蜜汁狀，風(fēng)味更加香甜醇厚。因此，三白瓜具有較高的綜合利用和研究開發(fā)價值。

目前三白瓜的研究和消費方式主要集中在瓜汁和瓜瓤直接生食或開發(fā)成果汁、瓜皮加工制成菜蔬或蜜餞，瓜子榨油等等，但開發(fā)成三白瓜發(fā)酵酒的研究及產(chǎn)品較少。

本研究擬以山西產(chǎn)三白瓜為原料，同時配合使用部分玉米深加工產(chǎn)品——淀粉糖漿，利用實驗室保藏的釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母，研究開發(fā)三白瓜發(fā)酵酒產(chǎn)品，以期為擴(kuò)大三白瓜增值途徑，提高三白瓜經(jīng)濟(jì)附加值，將我國三白瓜地方資源優(yōu)勢進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三白瓜：產(chǎn)地山西

酵母：釀酒酵母BH8（Saccharomyces cerevisia），中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，由李慧博士從中國科學(xué)院植物所的“北紅”釀酒葡萄中分離篩選；EnartsES181英納帝斯公司意大利，商業(yè)白葡萄酒釀造酵母。為方便說明，將酵母BH8和ES181重新編號為B和E。

玉米淀粉糖漿、F55果葡糖漿：中糧生化能源（衡水）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基（酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂2%、酵母粉、蛋白胨、瓊脂）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；10°P麥汁培養(yǎng)基：實驗室制備。

1.1.3 試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖：分析純，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、濃硫酸、冰醋酸、琥珀酸、乳酸、檸檬酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。果膠酶（XXL，酶活力1 400 PECTU）：諾維信（中國）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

IPP260低溫培養(yǎng)箱：德國Memmert公司；Scan1200自動菌落計數(shù)儀：法國Interscience公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO；THZ-98AB恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO公司；LA-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄：美國Supelco公司；6890N-5973I氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；7890B-5977榨汁機(jī)：九陽JYZ-V911。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母活化從斜面上挑取1環(huán)酵母菌，接入無菌的30 mL麥汁中，28 ℃搖床培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)速150 rpm。

1.3.2 三白瓜汁制備

自來水清洗干凈三白瓜后，用生理鹽水洗滌3遍，再用蒸餾水清洗3遍，控干，將三白瓜一分為二，剔除瓜籽，取瓜肉及瓜汁用打漿機(jī)破碎，添加0.03 g/L的果膠酶和70 mg/L的SO2，混合均勻3 h后，過濾備用。

1.3.3 成分調(diào)整

使用玉米淀粉糖漿調(diào)糖至120 g/L，使用檸檬酸調(diào)酸至4.6 g/L；

1.3.4 三白瓜酒釀造

使用滅菌的三角瓶，三角瓶體積/三白瓜汁的體積為5/2，活化菌種接種量為0.5%，靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃。使用透氣封口膜或添加有濃H2SO4的發(fā)酵栓封口。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)入無菌量筒并添加30 mg/L的SO2，4 ℃后發(fā)酵。

1.3.5 酵母生長測定

酵母菌液或三白瓜酒發(fā)酵液梯度稀釋后涂布YPD平板，28 ℃培養(yǎng)72 h后計算活菌落數(shù)。

1.3.6 葡萄糖、果糖、酒精的檢測

按李慧等[5]的方法，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad；USA）。柱溫：65 ℃；流動相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.600 mL/min。檢測器為示差檢測器，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.7 CO2失重的測定

接種前、接種后及發(fā)酵過程中，用電子天平稱重（精確到0.01 g）發(fā)酵瓶，稱前先搖晃三角瓶，以趕除二氧化碳。

1.3.8 總酸的測定

按國標(biāo)GB/T 15038—2006[6]指示劑法進(jìn)行。

1.3.9 總糖的測定

按國標(biāo)GB/T 15038—2006[6]直接滴定法進(jìn)行。

1.3.10 三白瓜酒香氣成分檢測

參考Xiao Z、王松廷等的方法檢測三白瓜酒的香氣成分[7-8]。

將固相微萃取頭插入氣相色譜的進(jìn)樣口中，270 ℃老化1 h，并進(jìn)行空白實驗，直至無色譜峰出現(xiàn)。將樣品裝入樣品瓶，裝液量為整個樣品瓶容積的1/3～1/2，并加入2 g氯化鈉，將固相微萃取頭插入樣品瓶中，45 ℃萃取45 min，在溫度為270 ℃的氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口中解吸5 min，進(jìn)樣分析。

氣相色譜（GC）條件：HP-INNOWAX MS型色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；柱溫起始為50 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升溫至160 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min升溫至230 ℃；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度為230 ℃，四級桿150 ℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍50～550 amu，無溶劑延遲。

定性分析方法：經(jīng)過分析得到的圖譜和美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，保留下匹配度＞80%的組分。

定量分析方法：采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，進(jìn)行定量分析

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗進(jìn)行3次，使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)為平均值±sd，使用軟件OriginPro 2016繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三白瓜酒的發(fā)酵速率及酵母生長曲線

發(fā)酵酒釀造過程中，酵母菌除了利用糖進(jìn)行生長繁殖外，還通過胞內(nèi)酶的作用把可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化成酒精等物質(zhì)[9]。酵母發(fā)酵速率及糖的轉(zhuǎn)化率是評價發(fā)酵酒主發(fā)酵進(jìn)程及發(fā)酵產(chǎn)品綜合品質(zhì)[10]的主要參數(shù)。

三白瓜酒發(fā)酵過程中CO2失重及酵母生長動態(tài)變化見圖1，

圖1 酵母菌株B和E在三白瓜汁中發(fā)酵CO2失重及酵母生長動態(tài)曲線

如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第2 d和第3 d時，商業(yè)酵母E和實驗室保藏酵母B分別開始進(jìn)入穩(wěn)定期，酵母數(shù)為1.52×109CFU/mL（E）和1.47×109CFU/mL（B）。CO2失重分別在第1.0 d（E）和第1.5 d（B）達(dá)到最大值，發(fā)酵至第6 d后，CO2失重穩(wěn)定在0.2 g/400 mL以下，基本達(dá)到發(fā)酵終點。結(jié)果顯示，實驗室保藏酵母和商業(yè)酵母在三白瓜汁中都表現(xiàn)出了較好的發(fā)酵性能，本研究所選用的兩株酵母可以用于三白瓜酒的發(fā)酵。

2.2 三白瓜酒發(fā)酵過程糖消耗及酒精產(chǎn)生的變化

三白瓜酒發(fā)酵過程中糖及酒精動態(tài)變化見圖2。

圖2 酵母菌株B和E在三白瓜汁中發(fā)酵糖消耗及酒精產(chǎn)生動態(tài)曲線

如圖2所示，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第2 d和第3 d時，商業(yè)酵母E和B的糖消耗速率和酒精生成速率加快，發(fā)酵至第6 d時，發(fā)酵液中的葡萄糖含量為0.37 g/L（B）和0.3 g/L（E），果糖含量為2.03 g/L（B）和1.05 g/L（E），未檢出蔗糖。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒總糖含量低于4 g/L，滿足干型果酒標(biāo)準(zhǔn)要求（NY/T 1508—2017）[11]及干型葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)要求（GB 15037—2006）[12]。發(fā)酵至第6 d時，發(fā)酵基本結(jié)束，最終產(chǎn)生的酒精濃度為5.96%（E），5.5%（B）。結(jié)果顯示，成分調(diào)整后的三白瓜汁適于酵母發(fā)酵釀造三白瓜酒。

2.3 三白瓜酒酸度及有機(jī)酸的含量

酸度對發(fā)酵酒品質(zhì)有直接影響，合適的酸度及不同的有機(jī)酸含量對酒體平衡以及滋味起著重要作用[13]。三白瓜酒酸度（酒石酸計）及有機(jī)酸的含量見表1。

表1 三白瓜酒酸度及有機(jī)酸的含量

如表1所示，發(fā)酵結(jié)束后，三白瓜酒酸度為5.06 g/L（B），5.30 g/L（E）。同時三白瓜酒釀造過程中會產(chǎn)生少量琥珀酸、乳酸和乙酸。琥珀酸濃度分別為0.19 g/L（B），0.20 g/L（E），乳酸濃度分別為0.63 g/L（B）和0.76 g/L（E）。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒中乙酸的含量都低于果酒標(biāo)準(zhǔn)要求（NY/T 1508—2017）[11]及葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)要求（GB 15037—2006）[12]。琥珀酸、乳酸和乙酸不存在于三白瓜中，是酵母在生長和發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物[14]。兩種酵母發(fā)酵的三白瓜酒中都檢出了琥珀酸、乳酸和乙酸，雖然含量不高，但對酒的酸味和酒體的穩(wěn)定性有重要影響[15]。

2.4 三白瓜酒香氣成分檢測

發(fā)酵酒釀造過程中，酵母可將原料中原有的成分轉(zhuǎn)化入酒體中，同時生成新的物質(zhì)，形成不同發(fā)酵酒的獨特風(fēng)味[16]。兩種三白瓜酒的香氣成分分析結(jié)果見表2。

表2 三白瓜酒香氣成分分析

續(xù)表2

如表2所示，兩種三白瓜酒中共鑒定出47種香氣成分。實驗室保藏酵母B發(fā)酵酒中檢測出36種，其中酯類14種，占33.51%；醇9種，占42.58%；酸3種，占7.62%。商業(yè)酵母E發(fā)酵酒中檢測出37種，其中酯類11種，占23.08%；醇8種，占52.97%；酸三種，占0.93%。

酯類物質(zhì)是通過酸和醇酯化反應(yīng)或者酵母代謝產(chǎn)生的，不同的酵母菌株細(xì)胞內(nèi)具有不同的酯酰輔酶A的活性[17]。辛酸乙酯、月桂酸乙酯和乙酸異戊酯賦予酒體水果香氣，癸酸乙酯具有椰子香氣。酵母B發(fā)酵酒中這4種酯類物質(zhì)相對含量為7.54%、1.94%、1.76%和3.26%，酵母E發(fā)酵酒為4.10%、3.74 %、0%和5.24%。因此，兩種酵母都可在三白瓜酒釀造過程中形成風(fēng)味較好的酯類化合物，酵母B在產(chǎn)酯類風(fēng)味物質(zhì)方面相對優(yōu)勢更大。

兩種發(fā)酵酒中的醇類物質(zhì)主要是乙醇，另外還檢測出異丁醇、異戊醇、苯乙醇和橙花叔醇和(±)-2-甲基-1-丁醇。苯乙醇和橙花叔醇可賦予酒愉快的花香味，酵母B發(fā)酵酒中苯乙醇和橙花叔醇的相對百分含量分別為3.79%和0.71%，酵母E發(fā)酵酒中為5.63%和1.12%。

兩種發(fā)酵酒中均檢出了乙酸、癸酸兩種酸，相對含量分別為0.17%和1.58%（B），0.31%和0.36%（E）。乙酸有強烈的酸味，癸酸具有愉快的脂肪氣味，它們在酒精飲料中的含量主要取決于所應(yīng)用的菌株[18]。酵母B發(fā)酵酒中還檢測出了具有水果香味的辛酸，相對含量為5.67%，這些有機(jī)酸對三白瓜酒的風(fēng)味有積極的貢獻(xiàn)。

色、香、味是構(gòu)成發(fā)酵酒的三要素，香氣成分的分子種類、含量、相互之間的比例及人們的感覺閾值決定了發(fā)酵酒的香味[19]。發(fā)酵酒發(fā)酵過程中，由于酵母菌株本身之間存在的差異，也將使發(fā)酵酒風(fēng)味物質(zhì)含量有所差異。香氣成分分析發(fā)現(xiàn)本研究使用酵母B發(fā)酵酒醇酯比為1.27，酵母E發(fā)酵酒醇酯比為2.30，感官品評兩種發(fā)酵酒，雖有差異，但都具有典型的三白瓜風(fēng)味，酒體相對協(xié)調(diào)。

3 結(jié)論

本研究以山西產(chǎn)三白瓜為主要原料，利用實驗室保藏的釀酒酵母和商業(yè)釀酒酵母，研究三白瓜發(fā)酵酒釀造工藝，測定了三白瓜酒釀造過程中的理化指標(biāo)并分析了三白瓜酒中的香氣成分。實驗結(jié)果表明，兩種酵母釀造的三白瓜酒，雖然香氣成分有差異，但兩種酵母都可以充分將三白瓜中的糖分轉(zhuǎn)化為酒精，代謝產(chǎn)生少量發(fā)酵酸。感官品評三白瓜發(fā)酵酒，酒體較協(xié)調(diào)并具有濃郁的三白瓜果香。本研究所選用的酵母可用于三白瓜果酒的釀造，配合使用部分玉米深加工產(chǎn)品——淀粉糖漿，可開發(fā)低酒精度的三白瓜發(fā)酵酒飲料，豐富三白瓜產(chǎn)品，提高三白瓜應(yīng)用開發(fā)價值。