秦 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

產(chǎn)蛋性狀是雞的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，其主要決定于雞卵巢中被募集的前等級(jí)卵泡的數(shù)目、發(fā)育程度、優(yōu)勢(shì)卵泡選擇和等級(jí)化的建立。而卵泡發(fā)育是一個(gè)高度調(diào)節(jié)、嚴(yán)格等級(jí)化的復(fù)雜調(diào)控過程，此過程除了受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG axis)激素的調(diào)控外，還受到許多生長因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路等不同方式的調(diào)節(jié)。雞RAC1基因位于14號(hào)染色體上，共有7個(gè)外顯子，編碼211個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。RAC1(ras-related C3 botulinum toxin substrate1)作為小G蛋白R(shí)ho亞家族中的一員，具有GTPase結(jié)合區(qū)，與GTP結(jié)合時(shí)被激活生物學(xué)活性，與GDP結(jié)合時(shí)失活，在體內(nèi)發(fā)揮分子開關(guān)的作用[1]。近年研究顯示RAC1分子還在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、調(diào)控細(xì)胞骨架、參與基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。然而，尚未見RAC1與雞前等級(jí)卵泡關(guān)系的研究報(bào)道。

本研究以150日齡的海蘭褐蛋雞前等級(jí)卵泡組織為素材，采用半定量RT-PCR和免疫組化的方法對(duì)RAC1分子的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，RAC1 基因在雞卵巢不同發(fā)育階段的前等級(jí)卵泡中均有表達(dá)，且隨著前等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖與分化，RAC1基因mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，在直徑6～8 mm 的卵泡中表達(dá)量最高，且RAC1 蛋白分子在不同發(fā)育階段的前等級(jí)卵泡中的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及膜層細(xì)胞中均有表達(dá)，初步揭示RAC1在mRNA水平和蛋白水平參與前等級(jí)卵泡的發(fā)育調(diào)控。通過分析雞RAC1分子在前等級(jí)卵泡中的時(shí)空表達(dá)特性和定位，可為進(jìn)一步研究RAC1在雞卵泡發(fā)育中的生物學(xué)功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物本研究擬選擇飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)水平相同的海蘭褐蛋雞20只，采取籠養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，每天8 h 光照(8L∶16 D)，自由采食和飲水。于150日齡，用乙醚將母雞麻醉后斷頸處死，迅速采集卵巢組織中前等級(jí)卵泡(直徑1～3.9，4～5.9，6～8 mm)，一部分放于液氮中冷凍保存，用于RNA的提取；一部分放入4%的多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，備用。

1.2 主要試劑RNA 提取試劑盒(Code:DP431)購自天根，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Code:RR047A)購自寶生物，Rabbit polyclonal to RAC1(Abcam)、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(博士德)， DAB染料、石蠟、二甲苯等均購自天根公司。

1.3 RNA的提取本研究使用RNA提取試劑盒(天根)，提取直徑1～3.9,4～4.9，5～8 mm的前等級(jí)卵泡RNA，然后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，測(cè)定其D值并檢驗(yàn)其純度，調(diào)整各組織樣總RNA濃度至2 g/L分裝于―70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中RAC1(NM_205017.1)和18S rRNA(FM165414.1)基因的mRNA為模板，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 RT- PCR 引物及PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.5 RT-PCR擴(kuò)增

1.5.1cDNA的合成 在0.2 mL的PCR管中加入提取的總RNA 1.0 μg，5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，加Rnase-free ddH2O至10.0 μL得試劑Total 1，再在試管中加入Total 1 10.0 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，5×PrimeScript 緩沖液24.0 μL，反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL，Rnase-free ddH2O 4.0 μL。輕輕混勻，37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)完成，cDNA 第一鏈合成。合成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2PCR反應(yīng) 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，分別PCR擴(kuò)增RAC1和18S rRNA基因的目的片段。先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳循環(huán)數(shù)，采用50 μL體系，加入cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，18S rRNA 上、下游引物(10 μmol/L) 各1 μL，2×EasyScriptTMHiFiPCRSuperMixⅡ 37 μL,最后加入雙蒸水5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；(94℃ 30 s，54℃ 30 s， 72℃ 30 s)，72℃ 延伸7 min，36個(gè)循環(huán)。降溫至4℃停止反應(yīng)后保存于-20℃。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀上觀察并拍照。利用系統(tǒng)軟件ImageJ2x和BandScan5.0進(jìn)行吸光值比較分析，確定目的基因在組織樣品中表達(dá)量的相對(duì)值，每個(gè)條帶圖重復(fù)測(cè)3次，取平均值。

1.7 石蠟切片的制備取固定好的前等級(jí)卵泡組織樣本，切成小方塊，在二甲苯中脫水，進(jìn)行透明處理30 min； 60℃恒溫水浴鍋中浸泡，分別為兩次軟蠟和兩次硬蠟；包埋、切片機(jī)切片，厚度大約5 μmol/L，切好的薄片在45℃的溫水中浸泡大約2 min，取出后放于攤烤機(jī)中，烘干備用。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)將制備好的石蠟切片放在60℃恒溫箱中60 min，進(jìn)行脫蠟，把切片放入100%,95%,85%,75%的酒精和ddH2O中分別浸泡5 min，取出后清洗3次。然后把切片放入盛有10 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液的壓力鍋中，煮沸4 min 后取出，用ddH2O和PBST(PBS溶液與表面活性劑Tween-20的混合液)清洗后血清處理封閉。加入用3% BSA-PBST稀釋的一抗，在4℃濕盒中孵育過夜，再室溫復(fù)溫60 min，再加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育60 min，再滴加DAPI避光孵育5 min，用DAB染色，封片。最后用OLYMPUS BX53型顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 總RNA所有樣品提取的總RNA，A260/A280的比值均在1.8～2.0，且28S，18S 2條帶明顯可見(圖1)，表明所提取的RNA純度高、無降解，可用于mRNA的表達(dá)譜分析。

圖1 總RNA提取結(jié)果 1～3.依次為1～3.9,4～5.9,6～8 mm

2.2 RAC1基因在雞前等級(jí)卵泡組織中表達(dá)特性分析經(jīng)PCR擴(kuò)增序列測(cè)序比對(duì)，RAC1基因的擴(kuò)增片段為232 bp,以18S RNA基因?yàn)閮?nèi)參，通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)雞RAC1基因mRNA在前等級(jí)卵泡中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，RAC1基因在雞不同直徑的前等級(jí)卵泡內(nèi)均有表達(dá)，但表達(dá)豐度存在一定的差異。其中在直徑6～8 mm 的卵泡中相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05)，為3.68，其次為直徑4～5.9 mm的卵泡，相對(duì)表達(dá)量為1.58，而在直徑1～3.9 mm卵泡中最低(P<0.05)，為1.21。結(jié)果表明，隨著雞前等級(jí)卵泡的增殖分化，RAC1基因mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，初步揭示了該基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平參與了前等級(jí)卵泡的發(fā)育調(diào)控。

圖2 雞RAC1基因mRNA在前等級(jí)卵泡中的表達(dá) M.DL2000 Marker;1～3.依次為1～3.9,4～5.9,6～8 mm

2.3 RAC1蛋白在雞前等級(jí)卵泡組織中的定位RAC1蛋白在雞前等級(jí)卵泡中的定位情況如圖4所示，由圖A、B、C可見，在不同發(fā)育階段的前等級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，均有明顯的棕黃色著色，呈較強(qiáng)的陽性信號(hào)；而在膜層細(xì)胞中也有棕黃色著色，但是陽性信號(hào)不明顯。圖D為陰性對(duì)照，全圖呈藍(lán)色，無棕黃色著色，即無免疫陽性信號(hào)。此結(jié)果說明RAC1蛋白主要在不同發(fā)育時(shí)期的前等級(jí)卵泡中的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜層細(xì)胞中表達(dá)，但RAC1蛋白主要分布細(xì)胞質(zhì)中，且在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的免疫陽性信號(hào)較強(qiáng)。

圖4 RAC1蛋白在雞卵巢前等級(jí)卵泡上(直徑1～8 mm)的定位 OC.卵母細(xì)胞;GC.顆粒細(xì)胞;TC.膜層細(xì)胞

圖3 RAC1基因mRNA在雞前等級(jí)卵泡中的相對(duì)表達(dá)量 字母不同表示顯著差異(P<0.05)

3 討論

雞卵泡的發(fā)育模式明顯區(qū)別于其他動(dòng)物，具有連續(xù)發(fā)育、等級(jí)排列和優(yōu)勢(shì)選擇等特點(diǎn)。卵泡按直徑大小分為前等級(jí)卵泡(直徑1～8 mm)和等級(jí)卵泡(排卵前卵泡 9～40 mm)。卵泡經(jīng)過優(yōu)勢(shì)選擇，在前等級(jí)卵泡的小黃泡(SYF)階段，大多數(shù)卵泡閉鎖或被吸收，只有少數(shù)卵泡(1～2個(gè))進(jìn)入等級(jí)化階段，說明被選擇進(jìn)入等級(jí)化的卵泡數(shù)目越多，產(chǎn)蛋性能越高[5-6]。因此，前等級(jí)卵泡的發(fā)育程度和被選擇的卵泡數(shù)目是決定母雞產(chǎn)蛋能力的關(guān)鍵因素。為什么前等級(jí)卵泡中只有少數(shù)卵泡(1～2個(gè))可以進(jìn)入等級(jí)化階段，而這一過程中哪些因子起了調(diào)控作用，尚未有明確解析。研究探討調(diào)控雞卵巢前等級(jí)卵泡發(fā)育的相關(guān)分子，對(duì)于揭示雞產(chǎn)蛋性狀形成的遺傳機(jī)理具有重要的理論價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義。

小G蛋白R(shí)AC1具有GTPase結(jié)合區(qū)， SLIT/ROBO通路偶聯(lián)的RhoGAP結(jié)構(gòu)域可通過刺激Rho家族蛋白內(nèi)在的GTP水解酶活性，抑制小G蛋白R(shí)AC1的活性[7]。SLIT/ROBO通路是一個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)途徑，在動(dòng)物的卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]，此表明，RAC1作為SLIT/ROBO通路的下游效應(yīng)分子，可能在調(diào)控雞前等級(jí)卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

有研究表明，RAC1參與調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化等過程[9-10]，本研究通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RAC1基因存在于雞卵巢卵泡中，并在雞不同直徑大小的前等級(jí)卵泡中均有表達(dá)，此結(jié)果表明，在雞前等級(jí)卵泡組織中， RAC1基因可能參與或維持前等級(jí)卵泡的正常生長發(fā)育。直徑6～8 mm的卵泡是優(yōu)勢(shì)卵泡選擇和等級(jí)化發(fā)育階段的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，而 RAC1基因mRNA的表達(dá)量在此期間波動(dòng)幅度較大，顯著高于其他階段(P<0.05)，說明RAC1基因在前等級(jí)卵泡的發(fā)育中一定以某種方式發(fā)揮作用。同時(shí)也提示，該基因與卵泡閉鎖和優(yōu)勢(shì)卵泡選擇有著密切的關(guān)系，這也是我們對(duì)RAC1基因在前等級(jí)卵泡中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行深入研究的原因之一，但其更具體詳盡的調(diào)控機(jī)制還有待研究。

在卵泡生長發(fā)育的過程中，卵泡中卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞之間的相互作用是卵泡發(fā)育成熟和維持正常功能的重要條件，也是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的靶細(xì)胞顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞，兩者之間高度協(xié)調(diào)互作，不斷進(jìn)行信息交流。卵母細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生信號(hào)維持顆粒細(xì)胞發(fā)育，但當(dāng)卵母細(xì)胞生長到一定程度時(shí)，就會(huì)抑制顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞生長的促進(jìn)作用[11-13]。為進(jìn)一步探討RAC1分子在前等級(jí)卵泡中如何定位及可能發(fā)揮的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方法對(duì)RAC1蛋白進(jìn)行定位研究，結(jié)果可見，雞RAC1蛋白質(zhì)分子主要在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜層細(xì)胞中表達(dá)分布，且主要存在于細(xì)胞質(zhì)。說明RAC1不僅參與了調(diào)節(jié)雞卵巢前等級(jí)卵泡的增殖分化，也可能與顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的信息交流密切相關(guān)。有研究報(bào)道，RAC1蛋白在人類卵巢和雞卵泡中均有表達(dá)，可通過促進(jìn)GDF9和BMP15的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)小鼠原始卵泡的形成，受RAC1調(diào)控的GDF9與BMP15可以通過旁分泌的方式作用于前體顆粒細(xì)胞[14]。而RAC1蛋白的表達(dá)定位可能是由于卵巢間質(zhì)相關(guān)細(xì)胞自分泌，即自我表達(dá)RAC1蛋白，或者也是通過旁分泌的方式，不同卵泡間進(jìn)行的調(diào)節(jié)表達(dá)，具體的作用方式及與各細(xì)胞之間的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

本研究采用了半定量RT-PCR方法對(duì)RAC1基因在雞卵巢不同直徑大小的前等級(jí)卵泡中mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明RAC1基因在雞不同直徑的前等級(jí)卵泡內(nèi)均有表達(dá)，但表達(dá)豐度存在一定的差異，在直徑6～8 mm卵泡中相對(duì)表達(dá)量顯著高于直徑4～5.9,1～3.9 mm卵泡(P<0.05)，表明RAC1基因在mRNA水平調(diào)控雞前等級(jí)卵泡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步探討RAC1蛋白分子的定位，采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)RAC1蛋白在前等級(jí)卵泡的表達(dá)模式進(jìn)行蛋白質(zhì)定位研究，結(jié)果顯示，RAC1蛋白主要在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜層細(xì)胞中表達(dá)分布，但膜層陽性信號(hào)較弱，進(jìn)而說明RAC1在前等級(jí)卵泡的發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。此結(jié)果為進(jìn)一步研究RAC1在雞卵泡發(fā)育中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。