張 輝，叢立新，魏 園，2，趙晨旭，劉國文

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動物科技學(xué)院, 吉林 吉林市 132101;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 吉林 長春 130118;3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 吉林 長春 130062)

瘤胃微生物在纖維素的降解過程中發(fā)揮著重要作用，全球每年植物通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達(dá)1.55×109噸，是地球生物圈中最豐富纖維素生物資源，但其中89%尚未被人類利用，纖維素生物質(zhì)資源的有效生物轉(zhuǎn)化對于可持續(xù)生化產(chǎn)品的生產(chǎn)極其重要[1]。瘤胃作為反芻動物消化吸收的重要生態(tài)系統(tǒng)，因其在高效降解木質(zhì)纖維素上的特殊地位，而成為微生物研究者及動物營養(yǎng)學(xué)者的重點(diǎn)關(guān)注對象[2]，國內(nèi)外學(xué)者利用分子生物學(xué)方法對纖維素酶分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入研究，但不同動物瘤胃微生物分泌纖維素酶的能力以及受飼料粗纖維的影響尚不清楚。梅花鹿作為具有典型特色的反芻動物，其瘤胃微生物具有顯著的適應(yīng)環(huán)境和飼料的特點(diǎn)，尤其是未受現(xiàn)代工業(yè)和生活污染的特性，使其成為研究瘤胃微生物的適宜材料。因此，本試驗(yàn)通過宏基因組測序方法對不同纖維素源日糧下梅花鹿瘤胃微生物進(jìn)行測序和分析，以能夠較深入的探索梅花鹿瘤胃樣品中的微生物酶功能多樣性，以及它們之間的相互作用機(jī)制，為更好的利用瘤胃微生物基因資源和反芻動物鹿的營養(yǎng)研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物分組與處理吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗(yàn)基地選擇健康、體質(zhì)量相近的3歲東北梅花鹿公鹿10頭。試驗(yàn)于2015年7月至9月進(jìn)行。TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

將10頭健康、體質(zhì)量相近的公鹿隨機(jī)分成JG、ZS 2組(每組5頭)，分別以玉米秸葉和柞樹葉為粗纖維源分別與精料混合均勻。飼養(yǎng)試驗(yàn)2個月。試驗(yàn)鹿每頭鹿分別隔開成一個喂飼和活動區(qū)域，每日采食飼料量為4.5 kg/頭。試驗(yàn)用東北梅花鹿不同粗纖維來源飼糧營養(yǎng)水平和組成見表1。

表1 試驗(yàn)用東北梅花鹿不同粗纖維來源飼糧營養(yǎng)水平和組成

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，瘤胃穿刺收集瘤胃液離心留取上清，使用TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒提取梅花鹿瘤胃液中微生物總基因，然后對所提取的DNA進(jìn)行質(zhì)檢。將質(zhì)檢過的基因組DNA打斷及相應(yīng)處理，收集一定長度范圍內(nèi)的目的片段完成測序文庫的構(gòu)建與Illumina MiSeq上機(jī)測序，測序后結(jié)果利用軟件CASAVA (version1.8.2)進(jìn)行圖像堿基識別(Base calling)和優(yōu)化數(shù)據(jù)，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后獲得PF data經(jīng)處理后進(jìn)行宏基因組的組裝?；诮M裝結(jié)果，進(jìn)行物種注釋及豐度分析、編碼基因預(yù)測，然后對預(yù)測出的基因進(jìn)行KEGG、CAZy 等數(shù)據(jù)庫的功能注釋分析。

2.1 檢測指標(biāo)瘤胃微生物總基因測序文庫測序后處理后獲得PF data經(jīng)處理后進(jìn)行宏基因組的組裝，然后進(jìn)行物種注釋及豐度分析、編碼基因預(yù)測，預(yù)測出的基因進(jìn)行eggNOG、KEGG、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CAZy)等數(shù)據(jù)庫的功能注釋分析。

2 結(jié)果

2.1 宏基因組測序結(jié)果不同處理組鹿瘤胃液樣品的宏基因組結(jié)果見表2。

由表2可知，通過宏基因組測序的JG和ZS 2組樣本的總堿基數(shù)量和總序列數(shù)量分別為11 150 909 160，12 540 742 633和75 018 396，84 518 090，且ZS組高于JG組，而2組樣品的平均序列分別為148.64，148.38 bp 。

表2 2組梅花鹿瘤胃液樣品的宏基因組測序結(jié)果

2.2 梅花鹿瘤胃樣品宏基因組測序的基因功能注釋基因KEGG 生物通路數(shù)據(jù)庫注釋分析結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，不同的代謝途徑在JG和ZS 2組差異很大，但2種樣品代謝途徑的模式總體上相似。其中新陳代謝強(qiáng)度ZS組顯優(yōu)于JG組。

圖1 2組梅花鹿瘤胃液樣品的KEGG pathway功能分類分布圖

CAZy功能注釋分析結(jié)果結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，雖然JG和ZS 2組的碳水化合物活性酶多樣性總體上相似，但各碳水化合物活性酶的豐度卻存在差異。JG和ZS 2組中GHs的含量最高，分別占總碳水化合物活性酶的49.44%，42.54%，其次為糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GTs)(23.38%，32.67%)、碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules，CBMs)(21.59%，15.78%)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs)(3.4%，6.79%)和多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)(1.95%，2.13%)，而輔助氧化還原酶(auxiliary activities，AAs)豐度最低，分別僅占總碳水化合物活性酶的0.24%，0.09%。

圖2 2組梅花鹿瘤胃液樣品的CAZy功能分類分布圖

eggNOG功能注釋分析結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，JG和ZS 2組的功能基因多樣性和豐度均存在差異，其中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)機(jī)制、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等參與主要代謝等功能基因在 2組樣品中占主導(dǎo)地位，而次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等功能基因的豐度相對較低些。

圖3 2組梅花鹿瘤胃液樣品的eggNOG功能分類分布圖

纖維素酶及半纖維素酶的優(yōu)勢類群的分析結(jié)果見表3,4。由表3可見，JG和ZS 2組樣品中約1/2以上的纖維素GHs來自于Ruminococcus(JG和ZS 2組樣品分別為52.79%，51.07%)和Fibrobacter(JG和ZS 2組樣品分別為14.22%，15.49%)。除此之外，還有約1%的纖維素GHs來自真細(xì)菌屬(Eubacterium),Prevotella和Clostridium中的一些種群。同時本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在瘤胃中大量存在的擬桿菌門中的擬桿菌屬(Bacteroides)對瘤胃中纖維素的降解卻沒有很大的作用。Epidinium和Polyplastron是原生動物，Piromyces屬于真菌門，它們對于纖維素的降解也具有重要作用。另外，JG組較ZS組總體微生物豐度總值高。

表3 編碼推定纖維素酶的優(yōu)勢類群的分析

由表4可見，JG和ZS 2組樣品中的很大部分半纖維素酶由Ruminococcus(39.20%,37.55%)，Prevotella(22.68%,20.66%)，F(xiàn)ibrobacter(8.86%，9.48%)，Clostridium(2.27%，1.94%)分泌(表4)。此外，Eubacterium，Bacteroides，Polyplastron和Epidinium也是分泌半纖維素酶的優(yōu)勢菌群，對半纖維素的降解有著不可或缺的作用。同樣，JG組較ZS組總體微生物豐度總值高。

表4 編碼推定半纖維素酶的優(yōu)勢類群的分析

圖5 2組梅花鹿瘤胃中參與半纖維素降解的各種GHs的豐度

圖6 2組梅花鹿瘤胃中參與寡糖降解的各種GHs的豐度

GHs家族參與植物細(xì)胞壁多糖的降解情況見圖4～6。由圖可見，共有24個GHs家族參與植物細(xì)胞壁多糖的降解，參與纖維素、半纖維素和寡糖降解的GHs在 2組梅花鹿瘤胃中含量豐富。在這24中GHs中，GH5、GH9、GH45和GH48為降解纖維素的優(yōu)勢酶類，GH8、GH10、GH11、GH26、GH28、GH51、GH53、GH78對于半纖維素降解起重要作用，而對于寡糖降解起主要作用的有GH1、GH2、GH3、GH43和GH94?？傮w趨勢顯示，ZS組參與寡糖降解的酶豐度值高于JG組，而JG組參與半纖維素降解的酶豐度值高于ZS組。

圖4 2組梅花鹿瘤胃中參與纖維素降解的各種GHs的豐度

3 討論

3.1 不同處理組鹿瘤胃液樣品的宏基因組測序結(jié)果在本試驗(yàn)中，玉米秸葉和柞樹葉喂飼的梅花鹿瘤胃微生物宏基因組測序結(jié)果顯示，JG和ZS 2組樣本的總堿基數(shù)量和總序列數(shù)量分別為11 150 909 160，12 540 742 633和75 018 396，84 518 090，ZS組高于JG組，而2組樣品的平均序列分別為148.64和148.38 bp，這可能是由于柞樹葉富含適宜瘤胃微生物生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，更適合瘤胃內(nèi)微生物大量的繁殖和生長[3]，因此ZS組樣品的總堿基數(shù)量和總序列數(shù)量均高于JG組。同時在表2中JG和ZS 2個樣本測序錯誤率小于1%的堿基數(shù)量百分比(Q20)、測序錯誤率小于0.1%的堿基數(shù)量百分比(Q30)和C+G 的堿基占所有堿基的數(shù)量百分含量(GC)分別為95.3%，94.4%和88.88%，87.08%以及44.29%，47.39%，Q20、Q30和GC數(shù)據(jù)顯示 2組樣本的數(shù)據(jù)均滿足試驗(yàn)要求，能夠較全面地反映樣品中功能基因的多樣性，為后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障。

3.2 梅花鹿瘤胃樣品KEGG pathway功能分析結(jié)果雖然JG和ZS 2組的代謝途徑的模式總體上相似，但各代謝途徑在JG和ZS 2組差異很大，其中新陳代謝途徑的差異最大，其在JG和ZS 2組的豐度分別為49.76%，61.62%。提示ZS組梅花鹿飼采食柞樹葉更有利于促進(jìn)新陳代謝率。這與魏園[4]報道結(jié)果一致。說明以柞樹葉為粗纖維來源組成的日糧對東北梅花鹿?fàn)I養(yǎng)需求與瘤胃發(fā)酵更為有利。

3.3 梅花鹿瘤胃液樣品的CAZy功能分析結(jié)果JG和ZS 2組的碳水化合物活性酶多樣性總體上相似，但各碳水化合物活性酶的豐度卻存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，JG和ZS 2組中GHs的含量最高，分別占總碳水化合物活性酶的49.44%，42.54%，其次為糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GTs)(23.38%，32.67%)、碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules，CBMs)(21.59%，15.78%)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs)(3.40%，6.79%)和多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)(1.95%，2.13%)，而輔助氧化還原酶(auxiliary activities，AAs)豐度最低，分別僅占總碳水化合物活性酶的0.24%，0.09%，說明2種處理梅花鹿瘤胃微生物功能參與碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的相關(guān)的基因是最多的，這些結(jié)果與張慧敏等[5]報道類似，本試驗(yàn)還顯示出JG組碳水化合物活性酶比例高于ZS組，提示JG組日糧中富含碳水化合物促成瘤胃更多的碳水化合物相關(guān)的酶基因表達(dá)。

3.4 梅花鹿瘤胃液樣品的eggNOG功能分析結(jié)果eggNOG數(shù)據(jù)庫根據(jù)細(xì)菌、藻類和真核生物完整基因組的編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建的基因直系同源簇。通過比對可以將某個蛋白序列注釋到某1個eggNOG 中，每一簇eggNOG 由直系同源序列構(gòu)成，從而可以推測該序列的功能[6]。本試驗(yàn)顯示，JG組和ZS組的功能基因多樣性和豐度有相同的趨勢，其中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)機(jī)制、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、物質(zhì)運(yùn)輸與代謝等功能基因在 2組樣品中占主導(dǎo)地位，而次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等功能基因的豐度相對較低些，這與印度水牛的報道相似報道類似[7]。

3.5 編碼推定纖維素酶、半纖維素酶的優(yōu)勢類群的分析結(jié)果在本試驗(yàn)中降解纖維素的GHs主要來自于Ruminococcus，F(xiàn)ibrobacter。而很大一部分半纖維素酶由Ruminococcus，Prevotella，F(xiàn)ibrobacter，Clostridium分泌。其中Fibrobacter可以合成大量具有降解纖維素和半纖維素能力的酶。另有文獻(xiàn)報道，瘤胃中降解植物細(xì)胞壁多糖的絕大多數(shù)GHs來自于擬桿菌門和厚壁菌門，少數(shù)由Fibrobacteres分泌[8]。后又有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃中降解植物細(xì)胞壁多糖的優(yōu)勢菌群[9]。

此外，參與纖維素、半纖維素的GHs在 2組梅花鹿瘤胃中含量豐富。在這24中GHs中，GH5、GH9、GH45和GH48為降解纖維素的優(yōu)勢酶類，GH8、GH10、GH11、GH26、GH28、GH51、GH53、GH78對于半纖維素降解起重要作用，參與纖維素、半纖維素的GHs JG組較ZS組總體微生物豐度總值均高。說明瘤胃厭氧真菌和原生動物能夠有效的降解纖維素，降解纖維素的優(yōu)勢酶GH5、GH9和GH48來源于瘤胃厭氧真菌和原生動物[10]。因此，厭氧真核微生物降解纖維素和半纖維素比降解寡糖能力要強(qiáng)。

3.6 參與半纖維、寡糖降解的各種GHs的豐度分析結(jié)果本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共有24個GHs家族參與植物細(xì)胞壁多糖的降解，其中GH5、GH9、GH45和GH48為降解纖維素的優(yōu)勢酶類，GH8、GH10、GH11、GH26、GH28、GH51、GH53、GH78對于半纖維素降解起重要作用，而對于寡糖降解起主要作用的有GH1、GH2、GH3、GH43和GH94。我們在JG和ZS 2組瘤胃樣品中發(fā)現(xiàn)很多降解植物細(xì)胞壁多糖的微生物，包括真核生物和原核生物。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)降解纖維素的GH5和GH9以及降解半纖維素的GH10，與張俊等[11]報道結(jié)果一致?？傮w趨勢顯示，ZS組參與寡糖降解的酶豐度值高于JG組，而JG組參與半纖維素降解的酶豐度值高于ZS組。分析其原因可能是由于纖維分解菌及其分泌的消化酶的活性對纖維素具有一定的依賴性，因此當(dāng)飼喂含纖維較多的玉米秸葉時降解纖維的菌群如瘤胃球菌屬和纖維桿菌屬為優(yōu)勢菌群，繼而分泌大量的纖維素和半纖維素降解酶；而飼喂含粗蛋白等碳水化合物較豐富的柞樹葉時降解可溶性蛋白質(zhì)、淀粉等非纖維植物成分的普雷沃菌屬等菌群為優(yōu)勢菌群，所以糖降解酶的含量降低。

本試驗(yàn)通過宏基因組測序技術(shù)研究不同日糧對梅花鹿的瘤胃功能能基因多樣性的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)飼喂粗纖維較多的日糧時，以降解纖維素為主的纖維降解酶的比例升高，而寡糖降解酶在瘤胃中的比例降低；當(dāng)飼喂含豐富可發(fā)酵碳水化合物的飼糧時，結(jié)果相反。為了這為進(jìn)一步探究梅花鹿瘤胃中各種微生物類群和功能基因的功能多樣性提供試驗(yàn)依據(jù)。