姚清國，單保恩

（1.石家莊學院化工學院，河北 石家莊 050035；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050019）

虎奶菇 [Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing]又名虎奶菌、南洋茯苓，屬于擔子菌亞門（Basidiomycotia） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），是一種珍貴食用菌，主要生長在非洲和東南亞，如尼日利亞、肯尼亞、馬來西亞等國家，我國主要分布于云南、江西、廣西等省[1]?；⒛坦礁缓鞍踪|(zhì)、多糖、礦物質(zhì)和揮發(fā)油等成分，其細胞壁中含有高度分支的多糖和蛋白復合物，其水提多糖和堿提多糖均具有三螺旋構象，且均具有較強抗氧化活性[2-3]?；⒛坦教崛∥飳π坌孕∈笊彻δ苡写龠M作用[4]；對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等為代表的革蘭氏陽性細菌有較強的抑制作用[5]；能夠降低小鼠的血糖含量、抗病毒[6]；可以通過激活巨噬細胞和相關酶來增強免疫系統(tǒng)，并誘導釋放細胞因子[7]；對用四氯化碳處理后的小鼠腎臟有保護和恢復作用[8]；其胞外多糖對小鼠有降血糖和降血脂的作用[9]；Lin等[10]證實了虎奶菇菌核中乙醇提取物具有抗氧化和抗血管生成的活性；陶詠真等[11]利用水提法從虎奶菇菌核中提取高支化葡聚糖及其衍生物具有體外抑制肝癌細胞增殖的作用。

以往的研究大多數(shù)是對虎奶菇子實體和菌核的成分分析，對液體培養(yǎng)菌絲體的研究并不多。本研究主要采用液體培養(yǎng)技術，獲得虎奶菇菌絲體，并對其分離提取，獲得乙酸乙酯和正丁醇提取物，驗證了其在體外抑制肺癌細胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種和菌株

虎奶菇菌種由河北省微生物制藥工程技術中心保存；肺癌細胞（A549）由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

菌種斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)主要成分為玉米粉、大豆餅粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氫鉀和硫酸鎂，石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、甲醇和氯仿等化學試劑為國產(chǎn)分析純；RPMI1640培養(yǎng)基購自蘇州旭太生物工程有限公司，胎牛血清購自于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜購自北京索萊寶科技有限公司，噻唑藍（MTT）購自生工生物工程上海股份有限公司。

1.3 菌絲體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.1 大豆餅粉添加量對液體培養(yǎng)菌絲生物量影響

從保存的試管菌種中切取黃豆大小菌種塊放入PDA平板中，25℃培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)接到新PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，重復3次。然后沿菌落邊緣切取8塊0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，放入250 mL三角瓶中培養(yǎng)。裝液量為100 mL，培養(yǎng)基主要成分為玉米粉（20.0 g·L-1）、葡萄糖（15.0 g·L-1）、蛋白胨（2.0 g·L-1）、磷酸二氫鉀（1.0 g·L-1）、硫酸鎂（0.5 g·L-1），大豆餅粉添加量為 2 g·L-1、4 g·L-1、6 g·L-1、8 g·L-1、10 g·L-1、12 g·L-1、14 g·L-1、16 g·L-1、18 g·L-1共9組，每組做3個平行。搖床培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液2 000 r·min-1離心5 min收集菌絲體，將菌絲體冷凍干燥，獲得干燥的虎奶菇菌絲體。稱重統(tǒng)計獲得菌絲量。通過優(yōu)化大豆餅粉的添加量獲得較高的菌絲產(chǎn)量。

1.3.2 不同pH對虎奶菇液體培養(yǎng)菌絲生物量影響

采用優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基配方，調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為 6.0、6.2、 6.4、 6.6、6.8、7.0、 7.2、 7.4、7.6，從活化好的虎奶菇PDA平板上，沿菌落邊緣切取8塊0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，放入250 mL的三角瓶（裝液量100 mL） 中培養(yǎng)，每組設置3個重復。在25℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液2 000 r·min-1離心5 min，收集菌絲體，將菌絲體冷凍干燥，稱重。通過優(yōu)化培養(yǎng)的pH來獲得較高的菌絲產(chǎn)量。

1.3.3 培養(yǎng)時間對液體培養(yǎng)菌絲生物量的影響

從活化好的虎奶菇PDA平板，沿菌落邊緣切取8塊0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，放入250 mL三角瓶（裝液量100 mL） 中培養(yǎng)，共9組試驗，每組3個平行，在25℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)，在120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h、 204 h、216 h各取出1組三角瓶，培養(yǎng)液 2 000 r·min-1離心5 min收集菌絲體，將菌絲體冷凍干燥，稱重。通過優(yōu)化培養(yǎng)時間來獲得較高的菌絲產(chǎn)量。

1.4 菌絲體提取物的分離純化

1.4.1 虎奶菇菌絲體乙酸乙酯提取物的分離純化

將干燥的虎奶菇菌絲體1 000 g用粉碎機打成粉末，先用石油醚和乙醚浸提，浸提后的沉淀再用5倍體積的乙酸乙酯室溫浸提24 h。將提取液與沉淀分離，乙酸乙酯提取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進一步濃縮，然后通過硅膠柱純化，用體積比為1∶2的氯仿和甲醇混合液洗脫，洗脫產(chǎn)物通過冷凍干燥稱重，獲得虎奶菇菌絲體乙酸乙酯提取物。

1.4.2 虎奶菇菌絲體正丁醇提取物的分離純化

將上步驟中乙酸乙酯初步浸提后的沉淀在室溫用正丁醇繼續(xù)浸提24 h。正丁醇浸提液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進一步濃縮，然后通過硅膠柱純化，用體積比為1∶1的氯仿和甲醇混合液洗脫，洗脫產(chǎn)物通過冷凍干燥稱重，獲得虎奶菇菌絲體正丁醇提取物。

1.5 菌絲體提取物對肺癌細胞生長的抑制試驗

1） 復蘇后的肺癌細胞（A549） 采用RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），置于37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶-EDTA消化對數(shù)期的細胞，離心收集。然后用新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液，再用血球計數(shù)板檢測細胞濃度，使其達到約5×104mL-1；將細胞懸液輕輕混勻，向微孔板每孔中加入100 μL細胞，培養(yǎng)24 h后進行試驗。

2）使用DMSO溶解虎奶菇乙酸乙酯提取物，加入微孔板的測試孔中，后用RPMI1640培養(yǎng)基進行稀釋，使其濃度分別為800.00 μg·mL-1、400.00 μg·mL-1、200.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、0（培養(yǎng)基、MTT），另設置對照組（細胞、培養(yǎng)基、MTT）。每組3個重復，培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。

3）參照2）方法進行虎奶菇正丁醇提取物試驗。

4） 采用MTT比色法測定各提取物對肺癌細胞增殖的影響[12]。在超凈臺中向微孔板每孔加入10 μL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h～6 h，小心吸掉上清液，然后每孔加入150 μL的DMSO溶解結晶，之后放到微量震蕩器上低速振蕩10 min。待結晶充分溶解后，用酶標儀在492 nm波長處測OD值。OD值的大小可以反映活細胞的數(shù)量，從而間接反映虎奶菇乙酸乙酯提取物對肺癌細胞（A549） 增殖的影響。

2 結果與分析

2.1 虎奶菇菌絲培養(yǎng)條件的優(yōu)化

虎奶菇菌絲體轉(zhuǎn)接至PDA平板后，菌絲顏色濃白，氣生菌絲密集，生長速度快，6 d左右長滿平板。后接種于液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的主要成分為玉米粉、葡萄糖、大豆餅粉，酵母提取物，通過調(diào)整培養(yǎng)大豆餅粉含量優(yōu)化培養(yǎng)基，得到最佳的培養(yǎng)條件，結果見圖1。

由圖1可知，大豆餅粉濃度從4 g·L-1開始，隨著濃度的增加，培養(yǎng)獲得的虎奶菇菌絲干重增加；在10 g·L-1時達到最大值，獲得的菌絲干重為14.73 g·L-1；大豆餅粉濃度從12 g·L-1開始，獲得的虎奶菇菌絲逐漸減少。因此，在培養(yǎng)中選取大豆餅粉10 g·L-1為最適的添加濃度。

采用優(yōu)化后培養(yǎng)基配方，調(diào)整不同pH的培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)條件的摸索，結果見圖2。

由圖2可知，培養(yǎng)基pH不同，其菌絲生長速率不同；從pH為6.0開始，隨著pH上升，培養(yǎng)獲得的菌絲逐漸增加；到pH為6.8時，培養(yǎng)獲得菌絲含量達到最大，得到菌絲體干重為16.9 g·L-1，后隨著pH的增加獲得的菌絲干重逐漸下降。因此，最適合虎奶菇菌絲生長的pH為6.8，此時獲得菌絲量最多。

培養(yǎng)時間對菌絲的重量也有影響，當培養(yǎng)時間短時，菌絲生長的比較少，培養(yǎng)時間過長時，菌絲會老化自溶，重量減少。采用搖瓶培養(yǎng)，從培養(yǎng)的第120小時開始統(tǒng)計獲得的菌絲量，結果見圖3。

由圖3可知，從第120小時開始，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲的重量不斷增加；在第168小時菌絲生長達到最大值，為17.5 g·L-1；此后隨著時間的增加，菌絲的干重開始減少，可見通過搖瓶培養(yǎng)時，其中虎奶菇生長的最適的培養(yǎng)時間為168 h，即7 d，此時獲得菌絲量最多。

2.2 提取物對肺癌細胞增殖的影響

對液體培養(yǎng)的虎奶菇菌絲體進行離心，獲得濕菌絲體進行冷凍干燥，粉碎成粉末，然后分別用乙酸乙酯、正丁醇進行浸提。浸提的產(chǎn)物濃縮后通過硅膠柱層析進行純化，純化產(chǎn)物進行后續(xù)的藥理學試驗，統(tǒng)計不同濃度的虎奶菇乙酸乙酯和正丁醇提取物對肺癌細胞A549增殖的影響作用，結果見表1。

由表1可知，乙酸乙酯提取物在濃度為6.25 μg·mL-1時抑制率只有8.23%。此后隨著濃度增加，對肺癌細胞的抑制率不斷增加。當達到800 μg·mL-1時，對肺癌細胞增殖的抑制率達到84.51%，經(jīng)計算其 IC50值為 252.62 μg·mL-1。正丁醇提取物在 6.25 μg·mL-1時對肺癌細胞增殖抑制率只有12.57%，此后隨著濃度增加，對肺癌細胞的抑制率不斷增加，當達到800 μg·mL-1時，對肺癌細胞的抑制率達到93.13%，經(jīng)計算其 IC50值為 108.25 μg·mL-1。肺癌細胞在不同濃度提取物下的生長狀態(tài)見圖4（A、B為虎奶菇菌絲體乙酸乙酯提取物濃度為6.25 μg·mL-1和800.00 μg·mL-1時肺癌細胞A549的生長狀態(tài)，C、D為虎奶菇菌絲體的正丁醇提取物濃度在6.25 μg·mL-1和 800 μg·mL-1時肺癌細胞 A549 的生長狀態(tài)，E為空白對照）。

表1 虎奶菇菌絲體提取物對肺癌細胞A549增殖的影響Tab.1 Inhibitory effect of extract of Pleurotus tuber-regium mycelium on the growth of lung cancer cells A549

由圖4 A可以看出，虎奶菇菌絲體乙酸乙酯提取物在濃度為6.25 μg·mL-1時對肺癌細胞A549的抑制作用較弱，細胞生長狀態(tài)基本正常，隨著提取物濃度的升高而抑制作用加強，如圖4 B所示，在乙酸乙酯提取物濃度在800.00 μg·mL-1時，培養(yǎng)后的細胞排列松散，生長密度小，個別細胞形狀不規(guī)則，說明該濃度下對肺癌細胞生長抑制作用比較強；如圖4C所示，在虎奶菇菌絲體的正丁醇提取物濃度為6.25 μg·mL-1時，對肺癌細胞增殖的影響比較小，培養(yǎng)后的細胞排列緊密，生長密度較大，圖4D所示，在正丁醇提取物在800.00 μg·mL-1時，對肺癌細胞增殖的抑制作用比較明顯，培養(yǎng)后的細胞形狀不規(guī)則、排列松散，生長密度小。圖4E為對照組。通過以上試驗可以推測虎奶菇菌絲體乙酸乙酯和正丁醇提取相中含有抑制肺癌細胞A549的活性成分。

3 結論與討論

通過搖瓶培養(yǎng)試驗得到虎奶菇優(yōu)化的培養(yǎng)工藝，其中大豆餅粉的濃度為10 g·L-1，培養(yǎng)基的pH為6.8，培養(yǎng)時間為7 d，在此條件下菌絲干重為17.5 g·L-1；虎奶菇乙酸乙酯和正丁醇提取物濃度在6.25 μg·mL-1～800.00 μg·mL-1均對肺癌細胞 A549 有抑制作用，且抑制作用隨濃度升高而不斷增強，經(jīng)計算乙酸乙酯和正丁醇提取物對肺癌細胞A549的抑制作用最強 （800.00 μg·mL-1），其 IC50值分別達到 252.62 μg·mL-1和108.25 μg·mL-1。

陶永真等[11]利用水提法從虎奶菇菌核中提取出一種高支化葡聚糖，將其硫酸酯衍生化，研究該多糖及其硫酸酯衍生物體外抗肝癌細胞株的活性，同時在小鼠體內(nèi)的測試了抗肉瘤 S180活性，證明該多糖及其硫酸酯化衍生物能誘導人體肝癌細胞凋亡。近期研究發(fā)現(xiàn)，水溶性虎奶菇多糖對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞SGC-7901增殖具有抑制作用，并能誘導腫瘤細胞凋亡[13]。通過對以往研究的進一步拓展，采用液體培養(yǎng)獲得虎奶菇菌絲體，將菌絲體提取物做抑制肺癌細胞生長的試驗，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和正丁醇提取物對肺癌細胞A549的增殖有一定的抑制作用，說明虎奶菇菌絲體中確實含有抑制肺癌細胞A549生長的有效成分，而其發(fā)揮功能的成分主要存在于乙酸乙酯和正丁醇提取分離物中，該結果為虎奶菇菌絲體的進一步開發(fā)提供理論基礎。