韓志俊

（遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563000）

虎奶菇（Pleurotus tuber-regium） 又稱核耳菇、茯苓側(cè)耳等，是一種木腐真菌[1]。虎奶菇核有極強(qiáng)的抗病能力，而且藥效保持時間很長，可以長年保存不腐、不變質(zhì)[2]?；⒛坦降淖訉?shí)體和菌核均可食用或藥用，特別是子實(shí)體中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是不可多得的美食[3]；虎奶菇還具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、解毒收斂的藥用功效，對咳嗽、哮喘有神奇的療效，而其藥用功效的主要物質(zhì)是虎奶菇多糖[4]。多糖又稱多聚糖（polysaccharide），主要分為植物多糖和動物多糖兩大類，研究表明多數(shù)食用菌均含有一定量的多糖[5]?；⒛坦蕉嗵强梢詮钠渥訉?shí)體或菌絲體發(fā)酵提取，也可以從其菌核中提取。其中，通過虎奶菇的子實(shí)體分離提取出的多糖因其組成成份多、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜而受到廣泛的關(guān)注?；⒛坦蕉嗵蔷哂姓{(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、對高血糖和高血脂的抑制作用，而且在抵抗癌細(xì)胞和腫瘤方面的有很好的療效，還有很多未知功效亟待發(fā)現(xiàn)[6]。通過對虎奶菇子實(shí)體多糖的提取工藝開展研究，并對其藥理作用進(jìn)行分析，以期為開發(fā)更多的虎奶菇多糖藥物及保健產(chǎn)品提供參考。

1 虎奶菇子實(shí)體多糖的提取工藝研究

1.1 提取工藝簡介

目前，虎奶菇子實(shí)體多糖主要是從虎奶菇干品或新鮮虎奶菇產(chǎn)品中提取分離得到，常用的提取方法有水提法、酶提法、酸提法、堿提法和超聲波、微波等輔助提取方法[7]，通過比較幾種虎奶菇子實(shí)體多糖的提取方法來確定最佳的提取工藝參數(shù)和條件，為虎奶菇資源的綜合開發(fā)利用和虎奶菇多糖保健品和藥品的加工提供理論依據(jù)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 藥品與試劑

無水乙醇，西安三浦化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（100 000 U·g-1），中山市鴻盛生物科技有限公司；果膠酶（100 000 U·g-1），夏盛（北京）生物科技開發(fā)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸，西安斯坦利生物科技有限公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BS323S電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；PB-1 pH計(jì)，德國Sartorius公司；DHG-9003電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海滬南科學(xué)儀器廠；SL3-120B超聲波清洗機(jī)，上海舍巖儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

1.3.1 虎奶菇子實(shí)體多糖的提取工藝

虎奶菇子實(shí)體經(jīng)清洗、晾干、切片，在60℃下烘箱中干燥60 min后，上粉碎機(jī)制成粉末狀，過80目篩后得虎奶菇子實(shí)體粉末備用。

1）水浸提虎奶菇子實(shí)體多糖

準(zhǔn)確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，置于一定溫度條件下的水浴鍋中保溫浸提一段時間，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實(shí)體粗多糖。

2）超聲波輔助提取虎奶菇子實(shí)體多糖

準(zhǔn)確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，置于一定溫度、一定功率條件下的超聲波清洗機(jī)中處理一段時間，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實(shí)體粗多糖。

3） 酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實(shí)體多糖

準(zhǔn)確稱取虎奶菇粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，分別加入一定量的酶及適量的蒸餾水，置于一定溫度、一定功率條件下的超聲波清洗機(jī)中處理一段時間，于100℃條件下保溫5 min滅酶，然后真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置12 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥即得虎奶菇子實(shí)體粗多糖。

1.3.2 虎奶菇子實(shí)體多糖得率的計(jì)算

采用重量分析法來確定虎奶菇子實(shí)體多糖得率（E，%），計(jì)算公式為：

式中：W1為虎奶菇子實(shí)體多糖的質(zhì)量（g）；W2為虎奶菇子實(shí)體粉末的質(zhì)量（g）。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探討固液比、浸提時間和溫度等單一因素對熱水浸提對虎奶菇子實(shí)體多糖提取效果的影響，其次再進(jìn)行熱水浸提的工藝參數(shù)優(yōu)化。

2.1 熱水浸提虎奶菇子實(shí)體多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 固液比對虎奶菇子實(shí)體多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取虎奶菇子實(shí)體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分別加入蒸餾水10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，置于溫度為60℃條件下的水浴鍋中保溫浸提4 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實(shí)體粗多糖，稱重后計(jì)算虎奶菇子實(shí)體多糖得率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在固液比為（1∶10）～（1∶30）時，隨固液比的增加多糖得率呈線性增加；但在（1∶30）～（1∶50） 時，虎奶菇子實(shí)體多糖得率先是緩慢增加后再下降。分析其原因可能是因?yàn)殡S著固液比的增大，溶劑中多糖總量有所增加；當(dāng)固液比達(dá)1∶30時，多糖得率達(dá)到最大，此時細(xì)胞內(nèi)外的濃度基本平衡；繼續(xù)增大固液比對多糖的得率影響很小，且溶劑用量過大會增加后續(xù)的濃縮時間，能耗增大。因此，綜合考慮選擇固液比為1∶30比較合適。

2.1.2 浸提時間對虎奶菇子實(shí)體多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取虎奶菇子實(shí)體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比1∶30加入蒸餾水30 mL，置于60℃的水浴鍋中保溫浸提1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實(shí)體粗多糖，稱重后計(jì)算虎奶菇子實(shí)體多糖得率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，浸提時間為1 h～3 h時，隨時間延長虎奶菇子實(shí)體多糖得率逐漸增加；在3 h～5 h時，得率上升變得緩慢。這可能是因?yàn)闀r間過短溶質(zhì)與溶劑的接觸不充分，多糖得率低，隨時間延長而多糖不斷溶出進(jìn)入到溶劑中，多糖得率隨之增大。因此，綜合考慮選擇浸提時間為3 h比較合適。

2.1.3 溫度對虎奶菇子實(shí)體多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取虎奶菇子實(shí)體粉末2.0 g置于200 mL錐形瓶中，按固液比1∶30加入蒸餾水30 mL，置于溫度為20℃、40℃、60℃、80℃、100℃條件下的水浴鍋中保溫浸提3 h，真空抽濾或離心得到濾液，將濾液真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h后過濾或離心分離得到沉淀，將沉淀置于60℃條件下干燥得到虎奶菇子實(shí)體粗多糖，稱重后計(jì)算虎奶菇子實(shí)體多糖得率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)浸提溫度為20℃～80℃時，虎奶菇子實(shí)體多糖得率隨溫度的升高逐漸增加，浸提溫度為80℃～100℃時，多糖得率的增加變得緩慢。這是因?yàn)闇囟壬呤沟梅肿拥臒徇\(yùn)動加快，有利于分子的溶出；但溫度超過90℃時，可能會對多糖的生物活性產(chǎn)生影響，同時會造成更多的能源消耗。因此，綜合考慮可選擇浸提溫度為80℃比較合適。

2.2 熱水浸提虎奶菇子實(shí)體多糖工藝的優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)確定了幾個重要的參數(shù)范圍，在此基礎(chǔ)上再根據(jù)響應(yīng)面原理[5]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 熱水浸提試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of hot water extraction test

如表1所示，通過組合設(shè)計(jì)對熱水浸提法提取虎奶菇子實(shí)體多糖的固液比、浸提時間和浸提溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 超聲波輔助提取對虎奶菇子實(shí)體多糖工藝的優(yōu)化

根據(jù)上述試驗(yàn)步驟，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定固液比為1∶30，超聲處理時間為30 min，超聲處理溫度為65℃，超聲處理功率為200 W。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化，依據(jù)響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的原理，對超聲波輔助提取虎奶菇子實(shí)體多糖的固液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率4個單一因素進(jìn)行優(yōu)化，最終得到超聲波輔助提取多糖的最佳工藝條件為：固液比1∶30，溫度68℃，功率190 W，此條件下虎奶菇子實(shí)體多糖得率為9.87%。

2.4 酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實(shí)體多糖工藝的優(yōu)化

采用上述試驗(yàn)方法，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇纖維素酶作為提取用酶種類，固液比為1∶30，加酶量為0.5%，酶解pH 5；結(jié)合超聲波輔助單一因素中，綜合考慮酶解時間等因素，超聲溫度為50℃、超聲時間為30 min、超聲功率為200 W時比較合適。

其次，在酶提法結(jié)合超聲波輔助提取虎奶菇子實(shí)體多糖工藝的優(yōu)化上，對固液比、加酶量（纖維素酶）、超聲時間和超聲功率各因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最終得到酶法結(jié)合超聲波輔助提取食用菌多糖的最佳工藝條件為：固液比1∶30，加酶量0.6%，超聲時間30 min，超聲功率200 W，此條件下虎奶菇多糖得率為13.05%。