周云，劉海龍，靳照宇

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.北京蛋白質(zhì)組研究中心 北京 102206 )

T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在細(xì)菌、病毒等病原體的免疫應(yīng)答，抵抗癌癥、感染以及自身免疫性疾病方面起著至關(guān)重要的作用[1-2].T細(xì)胞通過(guò)識(shí)別由抗原呈遞細(xì)胞捕獲的外源多肽段, 從而激活T 細(xì)胞及下游的一系列免疫反應(yīng).活化的T細(xì)胞可以誘導(dǎo)包括ζ-鏈相關(guān)蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)磷酸化、細(xì)胞因子分泌、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor kappa-B)、NFAT(nuclear factor of activated T-cells)激活等一系列生物學(xué)過(guò)程[3].

TCR(T cell receptor)是T細(xì)胞表面的標(biāo)志性受體，它與分化抗原簇3(cluster of differentiation 3, CD3)分子結(jié)合，形成TCR-CD3復(fù)合物.TCR通路在T細(xì)胞激活過(guò)程中具有重要作用，特異性的抗體識(shí)別TCR后，會(huì)激活TCR通路下游的一系列蛋白，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和活化等.

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室前期的工作，在TCR復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)了調(diào)控T細(xì)胞受體信號(hào)通路的有效分子PDIA3，該分子是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)，屬于二硫鍵異構(gòu)酶家族[4].PDIA3是一種巰基-氧化還原酶伴侶蛋白[4]，分子質(zhì)量為58 ku，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路中的一部分[5]，在多種細(xì)胞，尤其是免疫細(xì)胞中表達(dá)水平較高，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、主要組織相容性復(fù)合物組裝[6-7]、血小板功能[8]、轉(zhuǎn)錄[9]、骨發(fā)育[10]及凋亡誘導(dǎo)等多種重要的生物學(xué)過(guò)程.有研究表明，PDIA3在卵巢癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌和胃癌等多種癌組織中都有表達(dá)[4]. 到目前為止，幾乎沒(méi)有相關(guān)研究表明PDIA3表達(dá)與TCR信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的關(guān)系.由于PDIA3在免疫細(xì)胞中高表達(dá)，所以筆者提出假說(shuō)：PDIA3作為重要的免疫調(diào)控靶點(diǎn)，在TCR下游通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮重要作用.

本文旨在研究PDIA3對(duì)Jurkat T細(xì)胞中TCR下游通路的調(diào)控作用.利用電穿孔法將PDIA3基因的siRNA成功導(dǎo)入Jurkat T細(xì)胞中并成功敲低了PDIA3蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低了PDIA3蛋白能夠下調(diào)ZAP70蛋白的磷酸化水平，抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)繁殖標(biāo)記物CD69的表達(dá)以及IL-2的分泌，為今后深入研究PDIA3與TCR信號(hào)通路下游相關(guān)功能蛋白的相互作用提供了重要基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

Jurkat T和Jurkat-NF-κB T細(xì)胞株保存于本實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2 干涉序列

PDIA3基因的siRNA-794(5'-GGACAAGACUGUGGCAUAUTT-3')以及siRNA-NC(negative control siRNA, siNC)由蘇州吉瑪基因合成.

1.1.3 試劑材料

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco USA)；1640培養(yǎng)基(Gibco USA);放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA)；電轉(zhuǎn)緩沖液(HyClone EPB1)；電轉(zhuǎn)杯OC-100(MaxCyte OC-100 processing assembly)；一抗：Y319 Rabbit mAb 抗體(CST, 2701S)、PDIA3 Rabbit mAb抗體(proteintech, 15967-I-AP)、ZAP70 Rabbit mAb抗體(CST, 27054S)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mouse mAb抗體(北京傲銳生物科技有限公司，TA-08)；二抗：山羊抗兔IgG/辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(中杉金橋，ZB-2301)；山羊抗小鼠IgG/辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(中杉金橋，ZB-2305)；CD69抗體(invitrogen, 12-0699-42)；ONE-Glo熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega, E606B)；The BD OptEIATMReagent Set B(BD, 55-534)；BD OptEIATMHuman IL-2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinked immunosorbentassay,ELISA) Set(BD, 555190).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS的1640培養(yǎng)基,體積分?jǐn)?shù) 5% CO2, 37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)；細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶70%開(kāi)始下一步轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

收取約2×107T細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗1遍，用50 μL電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞.將細(xì)胞懸液與15 μL siRNA(20 μmol/L)混勻，加到電轉(zhuǎn)杯OC-100中，根據(jù)電轉(zhuǎn)儀操作手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn).結(jié)束后，立即取出細(xì)胞，移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并吹成液滴狀，放入培養(yǎng)箱中孵育，得到2組干涉后的細(xì)胞分別是Jurkat-siNC T和Jurkat-si794 T.孵育40 min后向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10 mL培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn).

1.2.3 Western blotting檢測(cè)

設(shè)置CD3抗體質(zhì)量濃度梯度分別為10、100、200 ng/mL 3組，每組中加1 μg/mL的CD28抗體協(xié)同刺激細(xì)胞，得到3組CD3/CD28抗體混合溶液(還有1組不加抗體刺激).收取Jurkat-siNC T細(xì)胞和Jurkat-si794 T細(xì)胞，用抗體混合溶液于37 ℃刺激細(xì)胞20 min.

取抗體刺激的細(xì)胞(～2×106)加入RIPA并超聲破碎提取蛋白，取12 μg蛋白經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE電泳，在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，利用兔抗人pZAP70(Y319)、ZAP70、PDIA3抗體和鼠抗人GAPDH抗體分別作為一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗3次膜，每次10 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG分別作為二抗室溫孵育90 min，TBST洗3次，Western blotting分析T細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)情況.

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD69的表達(dá)

設(shè)置CD3抗體質(zhì)量濃度分別為10、200、500、1 000 ng/mL，均加1 μg/mL的CD28抗體協(xié)同刺激細(xì)胞.將Jurkat-siNC T細(xì)胞和Jurkat-si794 T細(xì)胞用CD3/CD28抗體刺激12 h后，再用藻紅蛋白標(biāo)記的CD69抗體和isotype來(lái)識(shí)別CD69分子，4 ℃冰箱避光放置30 min，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3/CD28抗體激活的T細(xì)胞中CD69的表達(dá)情況.

1.2.5 ELISA試劑盒檢測(cè)IL-2分泌情況

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)實(shí)驗(yàn)孔和2個(gè)副孔，重復(fù)3次.用100 μL CD3抗體(5 μg/mL)提前包被96孔板，4 ℃過(guò)夜.將包被的96孔板用PBS洗3次.收取Jurkat-siNC T細(xì)胞和Jurkat-si794 T細(xì)胞，用CD28抗體稀釋液(1 μg/mL)重懸細(xì)胞，以每孔約2×105的細(xì)胞密度接種到96孔板中.CD3/CD28抗體刺激24 h后，收取上清液，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-2的分泌情況.

1.2.6 Luciferase assays檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)實(shí)驗(yàn)孔及2個(gè)副孔，重復(fù)3次.設(shè)置CD3抗體質(zhì)量濃度分別為1、3、5 μg/mL，均加1 μg/mL的CD28抗體協(xié)同刺激細(xì)胞.將Jurkat-NF-κB-siNC T細(xì)胞和Jurkat-NF-κB-si794 T細(xì)胞以每孔約2×105的細(xì)胞密度接種到96孔板中，用CD3/CD28抗體刺激6 h后，通過(guò)ONE-Glo熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中的熒光信號(hào)強(qiáng)度.

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

NC.siNC; 794. si794.下同. 圖1 PDIA3調(diào)節(jié)CD3/CD28抗體激活的ZAP70 蛋白的磷酸化水平Fig.1 PDIA3 regulates the phosphorylation of ZAP70 protein by CD3/CD28 antibodies

使用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及柱形圖的繪制.組間比較采用雙尾Student’s t-檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，組間差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 敲低PDIA3抑制ZAP70蛋白磷酸化

ZAP70 是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，屬于 Syk 蛋白家族.ZAP70 主要在 T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)，是 T 細(xì)胞受體活化所必需的蛋白.為了檢測(cè)PDIA3蛋白是否對(duì)ZAP70蛋白的磷酸化修飾有影響，進(jìn)行了siRNA細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)后48 h，用不同質(zhì)量濃度的CD3/CD28抗體協(xié)同刺激細(xì)胞.通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CD3抗體質(zhì)量濃度大于200 ng/mL時(shí)，ZAP70蛋白的磷酸化修飾水平(pZAP70(Y319))在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中幾乎無(wú)差別.猜測(cè)可能是CD3質(zhì)量濃度過(guò)高，導(dǎo)致T細(xì)胞活化效率太高.適當(dāng)降低CD3抗體的工作質(zhì)量濃度，分別用10、100、200 ng/mL CD3抗體和CD28抗體激活20 min,結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，成功敲低了PDIA3的蛋白表達(dá)，而且不同質(zhì)量濃度的CD3抗體刺激對(duì)ZAP70蛋白表達(dá)沒(méi)有影響.在CD3和CD28抗體的刺激下，對(duì)照組pZAP70(Y319)蛋白表達(dá)水平明顯提高，并且與CD3抗體的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，表明在抗體刺激下，ZAP70蛋白的磷酸化水平提高，但是在敲低了PDIA3蛋白之后，ZAP70的磷酸化水平幾乎沒(méi)有變化. 所以敲低了PDIA3蛋白會(huì)抑制ZAP70蛋白磷酸化，從而會(huì)影響T細(xì)胞活化.

2.2 敲低PDIA3抑制CD69的表達(dá)

CD69是T細(xì)胞活化后最早表達(dá)的表面抗原，是T細(xì)胞活化的早期標(biāo)志物，通常在抗體刺激1～2 h后即可在T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)CD69分子.為了探究PDIA3是否會(huì)對(duì)CD69的表達(dá)產(chǎn)生影響，用CD3/CD28抗體刺激細(xì)胞，由于前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)CD3抗體質(zhì)量濃度大于1 μg/mL時(shí)，超出儀器檢測(cè)范圍，所以適當(dāng)降低CD3抗體的工作質(zhì)量濃度.設(shè)置了不同質(zhì)量濃度的CD3(10， 200， 500， 1 000 ng/mL)加CD28(1 μg/mL)抗體協(xié)同刺激Jurkat-siNC T細(xì)胞和Jurkat-si794 T細(xì)胞，刺激 12 h后，加入CD69染色抗體來(lái)識(shí)別并標(biāo)記細(xì)胞膜上的CD69，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞膜上的CD69的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，當(dāng)CD3抗體質(zhì)量濃度為0也就是T細(xì)胞沒(méi)有被激活的狀態(tài)下，Jurkat-si794 T細(xì)胞與Jurkat-siNC T細(xì)胞的CD69表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，加入CD3/CD28抗體刺激T細(xì)胞后，2組細(xì)胞的CD69表達(dá)量升高，同時(shí)Jurkat-si794 T細(xì)胞組的CD69表達(dá)量顯著低于Jurkat-siNC T細(xì)胞組(P<0.05)，表明在敲低了PDIA3蛋白會(huì)影響CD69的表達(dá).當(dāng)CD3抗體質(zhì)量濃度為200 ng/mL時(shí)，2組的CD69表達(dá)量差異最大.所以在T細(xì)胞未活化情況下，PDIA3對(duì)CD69的表達(dá)沒(méi)有影響，當(dāng)T細(xì)胞活化后CD69表達(dá)顯著升高，而敲低PDIA3會(huì)對(duì)T細(xì)胞活化通路上CD69的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.

圖2 PDIA3對(duì)CD3/CD28抗體激活的Jurkat T 細(xì)胞CD69表達(dá)的調(diào)控Fig.2 PDIA3 regulates the expression of CD69 by CD3/CD28 antibodies in Jurkat T cells

2.3 敲低PDIA3抑制IL-2的表達(dá)

IL-2是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過(guò)TCR信號(hào)通路可以調(diào)控IL-2的基因表達(dá)，屬于TCR信號(hào)通路活化下游的一個(gè)分子，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)能誘導(dǎo)和增強(qiáng)B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的活力等，在調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用.因此，將Jurkat-siNC T細(xì)胞和Jurkat-si794 T細(xì)胞用CD3(5 μg/mL)加CD28(1 μg/mL)抗體刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中的IL-2分泌情況，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，敲低PDIA3可顯著抑制IL-2的表達(dá)(P<0.01)，所以敲低PDIA3后可能對(duì)T細(xì)胞的生長(zhǎng)分化產(chǎn)生影響.

圖3 PDIA3對(duì)CD3/CD28抗體激活的 Jurkat T細(xì)胞中IL-2分泌的調(diào)控Fig.3 PDIA3 regulates the secretion of IL-2 by CD3/CD28 antibodies in Jurkat T cells

2.4 敲低PDIA3對(duì)NF-κB信號(hào)通路的作用

NF-κB是一種重要的、普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，淋巴細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成等.如果NF-κB信號(hào)通路調(diào)控失衡，會(huì)導(dǎo)致多種人類(lèi)疾病，如慢性炎癥、腫瘤和原發(fā)性免疫缺陷病等.為了探究PDIA3是否參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，用CD3/CD28抗體刺激細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)CD3抗體質(zhì)量濃度小于1 μg/mL時(shí)，抗體對(duì)于細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活作用并不明顯.于是適當(dāng)提高CD3抗體的工作質(zhì)量濃度，分別用1、3、5 μg/mL CD3抗體和CD28抗體刺激細(xì)胞，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，當(dāng)不加入抗體刺激時(shí)，siNC組與si794組的熒光活性較弱且熒光強(qiáng)度無(wú)顯著性差異(P>0.05)，加入CD3/CD28抗體激活后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，不同質(zhì)量濃度梯度的CD3抗體刺激細(xì)胞，均可以激活NF-κB信號(hào)通路，但是敲低了PDIA3后，其熒光強(qiáng)度相比較于NC組具有顯著性差異(P<0.01)，所以敲低PDIA3能夠抑制NF-κB信號(hào)通路.

圖4 PDIA3對(duì)CD3/CD28抗體激活NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控Fig.4 PDIA3 regulates the NF-κB signaling by CD3/CD28 antibodies

3 討論

PDIA3是PDI家族的成員，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng).一些早期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，PDIA3在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成及化學(xué)抗性中發(fā)揮著重要作用[11].有研究表明，早期宮頸癌預(yù)后不良與PDIA3的下調(diào)有關(guān)[12].但是，在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)PDIA3表達(dá)上調(diào)[13].然而PDIA3在免疫組織中的功能研究尚不清楚.

在本研究中，利用電轉(zhuǎn)干涉在Jurkat T細(xì)胞中成功敲低PDIA3蛋白表達(dá).通過(guò)CD3/CD28抗體刺激活化T細(xì)胞，增強(qiáng)ZAP70蛋白的磷酸化修飾水平，結(jié)果表明,敲低PDIA3蛋白會(huì)減弱ZAP70蛋白的磷酸化修飾水平，表明PDIA3與T細(xì)胞的活化相關(guān)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證PDIA3與T細(xì)胞的活化相關(guān)，用CD3/CD28抗體刺激T細(xì)胞，并檢測(cè)早期活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)情況.結(jié)果表明，在T細(xì)胞未活化狀態(tài)下，CD69的表達(dá)量比較低，且敲低PDIA3對(duì)于CD69的表達(dá)量沒(méi)有影響.當(dāng)T細(xì)胞受到抗體刺激活化后，CD69的表達(dá)量顯著升高，敲低PDIA3會(huì)抑制CD69的表達(dá).ZAP70蛋白磷酸化水平的變化和CD69表達(dá)量變化表明 PDIA3蛋白參與了T細(xì)胞活化過(guò)程.T細(xì)胞的免疫應(yīng)答往往還與下游IL-2細(xì)胞因子的分泌以及遠(yuǎn)端NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，所以本文進(jìn)一步研究了PDIA3與IL-2細(xì)胞因子及NF-κB信號(hào)通路之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)敲低PDIA3會(huì)顯著下調(diào)IL-2的分泌.在Luciferase assays實(shí)驗(yàn)中，活化的T細(xì)胞會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，而敲低PDIA3能夠抑制NF-κB信號(hào)通路，表明PDIA3蛋白會(huì)參與調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答的下游通路.

本研究結(jié)果顯示，在T細(xì)胞中敲低PDIA3可以抑制ZAP70蛋白的磷酸化修飾、 CD69分子表達(dá)、IL-2分泌及NF-κB信號(hào)通路.因此，猜想PDIA3可能與下游的T細(xì)胞活化連接蛋白、含有SH2的白細(xì)胞蛋白76 kDa和磷脂酶C-γ1等分子的磷酸化修飾有關(guān).但是PDIA3對(duì)T細(xì)胞受體信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制以及對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子的影響是比較復(fù)雜的，需進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制做深入研究.未來(lái)本課題組準(zhǔn)備進(jìn)行磷酸化功能實(shí)驗(yàn)研究，檢測(cè)PDIA3分子對(duì)TCR信號(hào)通路下游的上述分子是否存在調(diào)控作用，并構(gòu)建PDIA3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證.本研究結(jié)果為今后對(duì)PDIA3與TCR下游一些功能蛋白的相互作用和分子機(jī)制研究提供重要基礎(chǔ).