袁 勛，鞠豐翼，張 玙，喬 斌，王志剛，杜之渝

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010；2.重慶明達(dá)眼科醫(yī)院眼科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma, Rb)為兒童最常見原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤[1-2]，目前臨床常用影像學(xué)檢查方法有CT、MRI、超聲及光學(xué)相干斷層掃描(ophthalmic optical coherence tomography, OCT)等，治療方法包括化學(xué)治療(簡稱化療)、放射治療及手術(shù)等，各有其不足[3-5]。納米技術(shù)用于治療腫瘤高效而安全[6]。單寧酸(tannic acid, TA)為多酚化合物,可通過綠色合成途徑與Fe3+合成具有強(qiáng)黏附能力的光熱材料單寧酸鐵(FeIII-tannic acid, FeⅢTA)[7]。全氟戊烷(perfluoropentane, PFP)沸點低(29℃)且易相變，可促進(jìn)藥物釋放，同時增強(qiáng)超聲顯像效果[8]。紫杉醇(paclitaxelaclitaxel, PTX)為常用化療藥物，將其與納米技術(shù)結(jié)合可獲得更高運載效率，提高腫瘤部位藥物濃度，增強(qiáng)治療效果[9-10]。本研究以FeⅢTA、PTX、PFP相結(jié)合制備光響應(yīng)性PLGA納米粒，并體外評估其超聲顯像及治療Rb效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料 羥基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 000 Da，聚合比50∶50，上海麗昂化學(xué)有限公司)，PTX(上海金穗生物科技有限公司)，PFP(Strem Chemicals公司)，TA(Sigma-Aldrich公司)，六水三氯化鐵[Iron(Ⅲ)chloride hexahydrate,FeCl3，賽默飛世爾科技有限公司]，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，Sigma公司)以及異丙醇、二氯甲烷、瓊脂糖、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清、細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒CCK-8(上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司)、活/死細(xì)胞雙染試劑盒(熒光探針細(xì)胞染色，上海復(fù)申生物科技有限公司)。Y79細(xì)胞系(人Rb細(xì)胞系)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所提供。

1.2 主要儀器 Sonics & Materials聲振儀，磁力攪拌器，低溫離心機(jī)，Olympus光學(xué)顯微鏡，Zeta SIZER3000HS馬爾文粒度儀，Htachi H-7600透射電子顯微鏡，Agilent Cary 3500紫外可見分光光度計，Shmadzu LC-2-1-A HT高效液相儀(日本島津公司)，808 nm激光儀，熱成像儀，Esaote Mylab 90型彩色超聲診斷儀(探頭頻率5～9 MHz)，ELX800酶標(biāo)儀，蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM800等。

1.3 制備納米粒 以雙乳化法制備PLGA/PTX/PFP納米粒，將50 mg PLGA和5 mg PTX加入2 ml二氯甲烷中并充分溶解。加入200 μl PFP，冰浴下乳化5 min(聲振、停止間隔5 s)，再加入4% PVA溶液5 ml，再次乳化5 min(聲振、停止間隔5 s)。加入2%異丙醇溶液10 ml，加磁珠冰浴攪拌6 h，經(jīng)超純水離心、洗滌3次，獲得PLGA/PTX/PFP納米粒。取1 mg PLGA/PTX/PFP納米粒均勻重懸于2 ml超純水，依次加入10 μl TA溶液(40 g/L)和10 μl FeCl3溶液(10 g/L)，充分混合均勻，經(jīng)超純水洗滌、離心3次，完成FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒制備。

1.4 測定相關(guān)表征 以光學(xué)顯微鏡觀察納米粒大小、分散性及相變特性,馬爾文粒徑分析儀檢測其粒徑、分布及電位。采用紫外分光光度計檢測1.000 g/L PLGA/PTX/PFP及不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 g/L)FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒的吸光度。以透射電子顯微鏡分析納米粒的結(jié)構(gòu)。配制不同濃度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/ml)PTX，用高效液相色譜儀繪制PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線(色譜柱：Welch-C18,4.6 mm×250 mm,流動相：甲醇∶水=77∶23，波長227 nm，流速：1 ml/min)，以有機(jī)溶劑(二甲基亞砜∶甲醇=1∶1)破壞納米粒后再次檢測并分析PTX含量，根據(jù)PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線計算包載的PTX質(zhì)量,得出PTX的包封率和載藥率。

將FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒隨機(jī)等量分成808 nm激光輻照組和未受激光輻照組，分別裝入透析袋，置于緩沖介質(zhì)中。于0.5、1、2、4、6、12、24 h對2組分別取樣，對激光輻照組在1 h采樣結(jié)束后立刻用808 nm激光(1 W/cm2)輻照5 min，再將透析袋放回緩沖溶液中繼續(xù)上述流程。以高效液相色譜儀檢測并繪制2組PTX藥物釋放率。

1.5 測定體外光熱效應(yīng) 對FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒按不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 g/L)分組，以1.000 g/L PLGA/PTX/PFP為納米粒組，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)為空白對照組，每組取200 μl分別置于96孔板中，經(jīng)808 nm激光(1 W/cm2)輻照10 min。以熱成像儀檢測各組溫度變化,光鏡下觀察FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒相變。

1.6 體外超聲顯像 取9 g瓊脂糖粉置于燒杯中，加入350 ml脫氣水，以微波爐加熱并充分?jǐn)嚢枞芙?，?00 μl規(guī)格槍頭盒裝滿槍頭，將瓊脂溶液緩慢注滿槍頭盒，待其等待自然冷卻，得到凝膠模型。取上述各濃度FeⅢTA/PTX/PLGA/PFP納米粒懸液和PBS各200 μl置于96孔板中，以PBS為對照組，用808 nm激光(1 W/cm2)輻照5 min后取出，置于瓊脂糖凝膠模型中，以超聲診斷儀分析顯像效果，測量超聲信號灰度值。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) 以含1%雙抗、10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育人源性Y79細(xì)胞系及HUVEC。

1.8 測定生物安全性 將HUVEC和Y79細(xì)胞分別置于96 孔板中孵育12 h，棄去孔中舊培養(yǎng)基，加入含0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g/L FeⅢTA/PLGA/PFP納米粒的新鮮培養(yǎng)基100 μl，繼續(xù)孵育24 h，然后棄去孔中舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再每孔加入100μl含10% CCK-8新鮮培養(yǎng)基孵育2 h，檢測吸光值A(chǔ)450；每組測量5次并分析。

1.9 CCK-8法檢測Y79細(xì)胞存活 將Y79細(xì)胞于96孔板中孵育12 h，棄掉舊培養(yǎng)基，分為空白對照組、激光組、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP(FPTP)組、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP+激光(FPTP+激光)組，分別加入納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入100 μl無血清培養(yǎng)基；予激光組和FPTP+激光組激光(1 W/cm2)輻照5 min，再次孵育6 h后加入CCK-8試劑并孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測吸光值A(chǔ)450，每組測量5次并分析。檢測不同濃度(0、0.250、0.500、1.000 g/L)FPTP+激光組納米粒的殺傷作用，方法同上。

1.10 活/死細(xì)胞法檢測Y79細(xì)胞存活 共聚焦皿板中孵育細(xì)胞12 h，棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml濃度1.000 g/L的不同納米粒無血清培養(yǎng)基，分為空白對照組、激光組、FPTP組、FPTP+激光組，加入不同納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml新鮮血清培養(yǎng)基，予激光組和FPTP+激光組經(jīng)激光(1 W/cm2)輻照5 min，再孵育6 h后，各皿中加入200 μl活/死細(xì)胞雙染試劑并孵育15 min，觀察各組細(xì)胞存活情況。

1.11 流式細(xì)胞法檢測Y79細(xì)胞存活 將Y79細(xì)胞置于48孔板中孵育12 h，棄掉培養(yǎng)基，加入濃度為1.000 g/L的無血清培養(yǎng)基200 μl，分為空白對照組、激光組、FPTP組、FPTP+激光組，分別加入納米粒后孵育4 h，再次棄掉培養(yǎng)基，加入200 μl無血清培養(yǎng)基；予激光組和FPTP+激光組經(jīng)激光(1 W/cm2)輻照5 min，再次孵育6 h后送檢。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以uation.3±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，兩變量之間關(guān)系采用線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 納米粒表征 成功制備出FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒，粒徑(155.8±55.68)nm(圖1A)，分散指數(shù)(PdI：0.100)，電位(-27.3±5.14)mV，其大小均勻，分散性好；透射電鏡下觀察，中心的PLGA/PTX/PFP納米粒被FeⅢTA外殼包裹(圖1B)。FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP的吸光度明顯高于PLGA/PTX/PFP，且隨濃度變化(圖1C)。PTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=19 414x+12 788，r=0.997 2；其包封率為(70.89±8.03)%，載藥率為(9.61±0.63)%，0.5 h和1 h時釋藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而激光輻照組PTX釋藥率明顯升高(P<0.05，圖1D)。

圖1 載FeⅢTA/PTX/PFP的PLGA納米粒相關(guān)表征 A.納米粒粒徑分布圖； B.透射電鏡圖； C.PTP納米粒和不同濃度FPTP納米粒吸光光度圖； D.FPTP納米粒體外紫杉醇釋放曲線圖

2.2 體外光熱效應(yīng)及光致相變 激光輻照不同濃度FPTP納米粒, 5 min時溫度上升趨于平穩(wěn),濃度越高溫度上升越快、越高，而PTP納米粒和PBS對照組溫度均未見升高(圖2A)。對于不同濃度FPTP納米粒，5 min時熱成像圖(圖2B)和溫度定量分析結(jié)果均呈正相關(guān)(r=0.842 8，P<0.05，圖2C)。光鏡下觀察，隨輻照時間增加，發(fā)生相變的FPTP納米粒逐漸增多(圖2D)。

圖2 納米粒光熱圖與光致相變圖 A.PTP納米粒和不同濃度FPTP納米粒經(jīng)近紅外激光輻照的升溫曲線圖； B.納米粒組激光輻照5 min的熱成像圖； C.不同濃度FPTP納米粒激光輻照5 min時溫度與濃度關(guān)系定量分析圖； D.FPTP納米粒經(jīng)激光輻照后相變圖

2.3 體外超聲顯像 超聲顯像中，激光輻照后，B模式和造影模式均可見明顯信號增強(qiáng)(圖3)；定量分析信號強(qiáng)度變化，隨納米粒濃度增加，B模式信號(r=0.991，P<0.01)及造影模式信號(r=0.992，P<0.01)均明顯增強(qiáng)并呈正相關(guān)。

圖3 不同濃度FPTP納米粒體外超聲顯像圖

2.4 生物安全性 不同濃度FPP納米粒對人正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均無細(xì)胞毒性(P>0.05)，見圖4A。

2.5 CCK-8法檢測Y79細(xì)胞存活情況(表1) 激光組對Y79細(xì)胞毒性殺傷作用與空白對照組納米粒比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，而FPTP+激光組強(qiáng)于FPTP組(P<0.01，圖4B)。0.250 g/L、0.500 g/L、1.000 g/L FPTP納米粒對Y79細(xì)胞的毒性殺傷作用均高于對照組(P均<0.01)，0.500 g/L、1.000 g/L組高于0.250 g/L組(P均<0.01)，而1.000 g/L組高于0.500 g/L組(P<0.01)，見圖4C。

圖4 納米粒細(xì)胞毒性作用 A.FPP納米粒對Y79細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的毒性； B.不同納米粒組對Y79細(xì)胞的殺傷情況； C.不同濃度FPTP+激光納米粒組對Y79細(xì)胞的殺傷情況

表1 各組Y79細(xì)胞存活情況(%)

2.6 活/死細(xì)胞法和流式細(xì)胞法檢測Y79細(xì)胞存活(表2) 空白對照組和激光組Y79細(xì)胞存活率均較高 (P>0.05)；FPTP組、FPTP+激光組Y79細(xì)胞存活率均低于空白對照組(P<0.01)；FPTP組Y79細(xì)胞存活率高于FPTP+激光組(P<0.01)，見圖5?？瞻讓φ战M和激光組Y79細(xì)胞凋亡均較少 (P>0.05)；FPTP組、FPTP+激光組Y79細(xì)胞凋亡率均高于空白對照組(P均<0.01)；FPTP組Y79細(xì)胞凋亡率低于FPTP+激光組(P<0.01)，見圖6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測不同納米粒組細(xì)胞凋亡 A.空白對照組； B.激光組； C.FPTP組； D.FPTP+激光組

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞存活情況 A.空白對照組； B.激光組； C.FPTP組； D.FPTP+激光組 (綠/紅色分別為活/死細(xì)胞)

表2 各組Y79細(xì)胞存活情況(%)

3 討論

目前治療Rb的優(yōu)先級順序依舊是拯救生命、保留眼球和保存視力[11]。對于較小腫瘤，經(jīng)瞳孔810 nm聚焦激光溫?zé)岑煼ㄊ鞘走x治療方法，OCT引導(dǎo)光凝治療對于治療肉眼不可見的新生Rb具有重要臨床價值[12]；但對較大腫瘤需多次由外至內(nèi)進(jìn)行光凝治療并結(jié)合化療[13]，在提高腫瘤部位藥物濃度、抑制腫瘤生長的同時降低藥物全身毒副作用[14-16]。通過結(jié)合納米技術(shù)和相變材料，可制備超聲分子探針，實現(xiàn)增強(qiáng)超聲顯像效果[17]。

相變材料的激發(fā)方式有多種選擇[18-19]。本研究將光凝治療、化療與超聲顯像相結(jié)合，制備出診療一體FPTP納米粒，可同時增強(qiáng)療效和超聲顯像效果，其粒徑為(155.8±55.68)nm，電位為(-27.3±5.14)mV，有利于通過腫瘤血管進(jìn)入腫瘤[20]；電鏡可見電子密度較高的FeⅢTA呈黑色，包裹住中間灰白色的PFP；FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP的吸光度主要來自FeⅢTA殼，也表明FeⅢTA成功搭載在納米粒上。PLGA/PTX/PFP納米粒和PBS均無法經(jīng)激光輻照產(chǎn)熱，提示FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP納米粒的光熱效應(yīng)來源于FeⅢTA。體外超聲顯像顯示，F(xiàn)eⅢTA經(jīng)激光激發(fā)產(chǎn)熱，促進(jìn)PFP相變，從而增強(qiáng)超聲顯像效果，兩種模式下回聲均隨納米粒濃度增加而逐漸增強(qiáng)。體外檢測FPTP納米粒在經(jīng)激光和未經(jīng)激光輻照下的PTX釋放結(jié)果表明PFP經(jīng)光熱激發(fā)后發(fā)生相變，促進(jìn)PTX的藥物釋放。體外生物安全性實驗結(jié)果顯示，高濃度FPP納米粒在未經(jīng)激光激發(fā)的情況下不會對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞造成損害，具有較好的生物安全性。體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，單一激光輻照不會對細(xì)胞造成殺傷效果，同時FPTP納米粒未經(jīng)激光輻照時雖可緩慢地釋放PTX，但對腫瘤的殺傷效果有限，而FPTP納米粒經(jīng)激光輻照可迅速提高藥物濃度，達(dá)到光熱治療和化療協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。將光熱治療和化療相結(jié)合，腫瘤細(xì)胞殺傷效果明顯增強(qiáng)，且隨濃度升高而增強(qiáng)。激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果顯示FPTP+激光組對腫瘤細(xì)胞殺傷效果最強(qiáng)，為進(jìn)一步開展體內(nèi)動物實驗奠定了基礎(chǔ)。