胡玉燕， 尹磊， 張晨笑， 錢暉

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進(jìn)展到終末期的病理損傷過程，其主要發(fā)生機制為正常傷口愈合的病理性擴展，表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞活化，細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積以及炎性細(xì)胞的大量浸潤[1]。目前臨床研究中發(fā)現(xiàn)一些抗纖維化劑可有效降低甚至逆轉(zhuǎn)纖維化，但針對人類有效的抗纖維化治療方法仍受到限制[2]。因此，緩解腎臟纖維化是迫切需要解決的一大難題。

外泌體(exosomes)是由細(xì)胞分泌的一類直徑在30～200 nm的膜性囊泡，富含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，在細(xì)胞外環(huán)境中進(jìn)行信號和分子的交流傳遞[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，hucMSC-Ex)在肝纖維化、炎性腸病、燙傷皮膚創(chuàng)面愈合、急慢性腎損傷等多種疾病模型中發(fā)揮修復(fù)作用[4-7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex可抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta-1，TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[8]，然而，hucMSC-Ex在腎間質(zhì)纖維化中能否發(fā)揮作用尚不清楚。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法模擬體內(nèi)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)導(dǎo)致的腎臟纖維化，探討hucMSC-Ex在大鼠腎纖維化過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)液、特級胎牛血清(以色列Bioind公司)；100 kDa MW CO 超濾離心管(MBI公司)；外泌體提取試劑(美國SBI公司)；細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液RIPA和酶抑制劑(美國Pierce公司)；鼠抗人CD9單克隆抗體、兔抗人CD63多克隆抗體及兔抗人CD81多克隆抗體(美國Proteintech公司)；兔抗人β-肌動蛋白多克隆抗體、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(美國Bioworld公司)；鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(博士德公司)；兔抗人波形蛋白單克隆抗體、兔抗人N-鈣黏蛋白多克隆抗體(美國CST公司)；兔抗人E-鈣黏蛋白多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；羊抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗、驢抗兔IgG熒光二抗(美國Invitrogen公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)； 細(xì)胞超凈臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；ImageQuant LAS400mini化學(xué)發(fā)光成像儀(日本GE公司)；倒置式生物顯微鏡(日本Nikon公司)；免疫組織化學(xué)染色試劑盒、Masson 染色試劑盒(博士德公司)；超聲波破碎儀(美國Branson公司)。

1.2 hucMSC-Ex收集、提取和鑒定

臍帶標(biāo)本來源于江蘇大學(xué)附屬四院。根據(jù)本實驗室前期建立的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體提取方法[9]，收集對數(shù)生長期hucMSCs的培養(yǎng)上清液。超濾濃縮上清液，加入外泌體提取試劑沉淀，獲得hucMSC-Ex，透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體表面標(biāo)志CD9、CD63和CD81及納米流式檢測粒徑大小，分裝保存于-80 ℃。

1.3 UUO模型及治療模型構(gòu)建

SD雄性大鼠購于江蘇大學(xué)實驗動物中心，體重180～200 g。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、UUO 組和hucMSC-Ex組，每組6只。UUO組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，經(jīng)腹部左側(cè)開口，找到輸尿管后用4-0手術(shù)縫合線進(jìn)行結(jié)扎，之后用2-0手術(shù)線進(jìn)行縫合。假手術(shù)組在找到輸尿管后不做處理，直接縫合。hucMSC-Ex處理組在術(shù)后24 h尾靜脈注射250 μg hucMSC-Ex，之后每隔2 d注射1次，共計3次。7 d后處死大鼠，摘取左側(cè)腎臟，用PBS洗凈，將腎臟橫切一分為二，一半置于4%多聚甲醛固定，用于組織石蠟包埋切片；一半置于-80 ℃保存用于蛋白質(zhì)檢測。

1.4 Masson染色觀察腎組織膠原沉積

腎組織石蠟切片首先于65 ℃ 烘箱烤片6 h，依次放入二甲苯15 min/次×2次，100%、95%、90%、80%、75%、70%乙醇各2 min脫蠟，流水沖洗。0.5%碘酒溶液10 min，水洗；0.5%硫代硫酸鈉溶液處理5 min，水洗；30%飽和苦味酸乙醇溶液固定30 min，水洗；蘇木素染核10 min，充分水洗；玻片烘干后滴加麗春紅酸性復(fù)紅染色液，室溫20 min，0.2%冰醋酸水溶液清洗玻片；磷鉬酸水溶液分化處理2 min，甩干后苯胺藍(lán)染色5 min；冰醋酸水溶液洗滌。脫水過程為脫蠟的逆過程，方法如上，最后用中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.5 HE染色觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染核5 min，充分水洗；甩干后滴加1%鹽酸乙醇作用30 s，棄掉溶液后直接滴加1%氨水30 s返藍(lán)，充分水洗；0.5%伊紅染液染色90 s，水洗。最后對切片進(jìn)行脫水處理，中性樹脂封片鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色觀察腎組織內(nèi)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)

石蠟切片脫蠟脫水過程同上。3% H2O2室溫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，組化PBS洗滌3次；枸櫞酸鹽緩沖液蒸煮30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，洗滌3次；然后用5% BSA室溫封閉1 h，甩干后直接孵育一抗，一抗稀釋比α-SMA(1 ∶ 100)，TGF-β1(1 ∶ 100)，4 ℃孵育過夜，洗滌3次；滴加二抗，室溫孵育30 min，洗滌；滴加SABC，37 ℃ 30 min，洗滌；最后，每張切片滴加DAB顯色劑，鏡下顯色5～10 min，待組織切片出現(xiàn)棕黃色陽性區(qū)域后用蒸餾水終止，蘇木素染核20 s，流水沖洗后，脫水封片，鏡下觀察。

脫蠟及孵育一抗同上，一抗稀釋比例E-鈣黏蛋白(1 ∶ 100)、N-鈣黏蛋白(1 ∶ 100)。隨后加入 FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃濕盒放置45 min，PBS 洗滌4次，每次5 min；加入Hoechst避光染5 min，PBS 洗滌4次，每次5 min。甘油封片后，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測腎臟纖維化相關(guān)蛋白

取1 g腎臟組織加入150 μL蛋白裂解液，超聲波破碎細(xì)胞提取組織蛋白。配制12% SDS-PAGE分離膠，以180 μg上樣。80 V恒壓電泳至目的條帶分離。350 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后孵育一抗，β-肌動蛋白稀釋比為1 ∶ 2 000，TGF-β1、波形蛋白、E-鈣黏蛋白稀釋比均為1 ∶ 500。4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌。加入HRP標(biāo)記的驢抗兔抗體(1 ∶ 2 000)，37 ℃孵育1 h，洗滌。洗滌后采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行凝膠成像。

2 結(jié)果

2.1 hucMSC-Ex的觀察和鑒定

實驗提取的hucMSC-Ex經(jīng)電子透射電鏡觀察，外泌體為盤狀囊泡(圖1A)；粒徑分布在50～200 nm之間，主要集中在110 nm左右(圖1B)；蛋白質(zhì)印跡檢測顯示hucMSC-Ex表達(dá)標(biāo)志分子CD9、CD63和CD81(圖1C)。

A：透射電子顯微鏡觀察hucMSC-Ex形態(tài)；B：納米流式技術(shù)分析hucMSC-Ex粒徑分布；C：蛋白質(zhì)印跡檢測hucMSC-Ex表面標(biāo)志

2.2 hucMSC-Ex 對UUO大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響

SD大鼠結(jié)扎7 d，肉眼可見左側(cè)腎臟明顯腫大，近腎端輸尿管充盈大量炎性液體，并且與周圍組織粘連嚴(yán)重。經(jīng)尾靜脈注射hucMSC-Ex干預(yù)后，腎臟外觀與UUO組相比有明顯改善，外觀鮮紅，表面瘀血減少，壞死區(qū)域較少(圖2)。

HE染色結(jié)果表明，UUO組大鼠腎臟基本結(jié)構(gòu)消失，大量成纖維細(xì)胞增生；hucMSC-Ex組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)有所改善，腎小管萎縮得到緩解，炎性因子浸潤和成纖維細(xì)胞增生減少，壞死區(qū)域有所減緩(圖3)。Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎臟組織無明顯的膠原沉積；UUO組中有被染成藍(lán)色的片狀陽性區(qū)域，且多分布在腎小管周圍，表明有大量的膠原纖維沉積在腎間質(zhì)；hucMSC-Ex組大鼠腎臟組織藍(lán)色區(qū)域明顯減少，成條索狀分散在少數(shù)腎小管周圍(圖4)。以上結(jié)果證明hucMSC-Ex能在UUO誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮抑制作用，改善腎臟結(jié)構(gòu)，減少膠原沉積，延緩腎纖維化進(jìn)展。

圖2 輸尿管結(jié)扎7天大鼠左腎橫切面觀察

圖3 HE染色觀察大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)(×400)

圖4 Masson染色觀察大鼠腎臟組織膠原沉積(×400)

2.3 hucMSC-Ex對UUO大鼠腎臟組織EMT的影響

免疫組織化學(xué)檢測α-SMA和TGF-β1在腎組織內(nèi)的表達(dá)，UUO組病變部位有大量的棕黃色陽性顆粒沉積，而hucMSC-Ex組陽性區(qū)域明顯減少(圖5)。蛋白質(zhì)印跡顯示，UUO組TGF-β1和波形蛋白的表達(dá)高于假手術(shù)組，而E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)；hucMSC-Ex組TGF-β1和波形蛋白的表達(dá)減少， E-鈣黏蛋白含量上調(diào)(圖6)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示hucMSC-Ex能夠增加E-鈣黏蛋白表達(dá)，減弱N-鈣黏蛋白表達(dá)(圖7)。結(jié)果表明hucMSC-Ex能夠抑制腎間質(zhì)中TGF-β1等促纖維化因子的表達(dá)，并且能夠逆轉(zhuǎn)EMT，從而起到保護腎臟的作用。

圖5 免疫組化檢測各組大鼠腎組織α-SMA 和TGF-β1的表達(dá)(×400)

3 討論

干細(xì)胞來源的外泌體以其免疫原性低、穩(wěn)定、可量產(chǎn)等諸多優(yōu)勢，在免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗纖維化、增強血管再生等方面發(fā)揮了重要作用[10]。本研究探討hucMSC-Ex對大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用，結(jié)果顯示hucMSC-Ex干預(yù)后炎性因子浸潤減少，腎間質(zhì)空泡變性好轉(zhuǎn)，腎小管結(jié)構(gòu)較清晰，提示hucMSC-Ex能夠有效緩解輸尿管梗阻引起的腎臟炎癥和纖維化的進(jìn)展，改善腎臟的功能。

圖6 蛋白質(zhì)印跡檢測各組大鼠腎組織TGF-β1及EMT指標(biāo)

圖7 免疫熒光檢測腎臟組織E-鈣黏蛋白(×400)和N-鈣黏蛋白(×200)表達(dá)

TGF-β信號通路作為關(guān)鍵介質(zhì)參與器官纖維化進(jìn)程，其中TGF-β1被認(rèn)為是炎癥性疾病轉(zhuǎn)變至纖維化的重要細(xì)胞因子[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的外泌體可以通過下調(diào)TGF-β1調(diào)節(jié)受損子宮內(nèi)膜的纖維化修復(fù)[13]。本研究中大鼠輸尿管梗阻后引起腎組織TGF-β1和α-SMA高表達(dá)，hucMSC-Ex處理后能夠下調(diào)纖維化相關(guān)蛋白TGF-β1、α-SMA和波形蛋白的表達(dá)。此外，腎小管細(xì)胞在損傷狀態(tài)下能夠發(fā)生EMT，并通過旁分泌方式顯著地促進(jìn)炎癥和纖維形成[14]。損傷發(fā)生后，炎癥性細(xì)胞因子、機械應(yīng)力或化學(xué)(激素類)物質(zhì)會刺激EMT，研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex能夠抑制CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化中的EMT發(fā)生[15]。我們的結(jié)果顯示，在UUO模型中波形蛋白的表達(dá)水平增加，E-鈣黏蛋白含量下調(diào)，hucMSC-Ex干預(yù)能夠促進(jìn)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制波形蛋白的表達(dá)。由此表明，hucMSC-Ex可能通過TGF-β信號通路逆轉(zhuǎn)EMT從而延緩腎間質(zhì)纖維化，提示hucMSC-Ex干預(yù)可能成為緩解甚至治療腎間質(zhì)纖維化的一種新型療法。

干細(xì)胞外泌體是干細(xì)胞旁分泌的一類囊泡，內(nèi)部包裹多種干細(xì)胞獨特的基因產(chǎn)物和大量的miRNAs，參與細(xì)胞通訊，維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其中外泌體miRNAs信號傳遞被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊新的方式[16]。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-let-7c的工程化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠歸巢到受損的腎組織并上調(diào)miR-let-7c，同時外泌體中攝取大量miR-let-7c抑制TGF-β1受體有效地發(fā)揮體外抗纖維化作用[17]。另外肌內(nèi)注射過表達(dá)miR-29的外泌體能夠有效緩解UUO誘導(dǎo)的腎纖維化，減少腎臟組織中TGF-β、α-SMA和膠原的表達(dá)[18]。為了探索外泌體miRNAs的治療效果，課題組開展了hucMSC-Ex的miRNAs測序，生物信息學(xué)分析顯示在hucMSC-Ex中存在大量高表達(dá)的miRNAs分子。我們將在后續(xù)研究中探究是否存在抑制腎纖維的特異性功能miRNAs，對hucMSC-Ex在腎臟纖維化中抑制TGF-β1逆轉(zhuǎn)EMT的具體機制作進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究顯示hucMSC-Ex能夠有效延緩大鼠UUO導(dǎo)致的腎纖維化，但其是否能夠抑制人類腎臟纖維化還有待進(jìn)一步證實。另外，本實驗針對的是腎臟纖維化進(jìn)展前期的干預(yù)性治療，對衰竭中晚期的腎臟是否有緩解作用還需進(jìn)一步實驗。