徐琛， 劉競麗

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 廣西 南寧 530000)

miRNA是一種短鏈非編碼小RNA，與靶基因mRNA 3′UTR端相互作用，阻止其翻譯[1]。研究報道，miR124在腦中高表達(dá)，可激活PI3K/AKT/mTOR通路，參與缺血性腦卒中發(fā)生[2]。在外周神經(jīng)損傷后不同時間鞘內(nèi)注射miR133b-3p，可防止或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理性疼痛，如機(jī)械性疼痛或寒冷性疼痛[3]。另有報道證實表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠慢性阻塞性肺疾病， 通過調(diào)控肺 miR133a/b-3p 和 TGF-β1/Smad3 水平，抑制氧化應(yīng)激和炎癥[4]。關(guān)于miR133b-3p在缺血性腦灌注損傷后的表達(dá)及機(jī)制尚不明確，本研究通過高通量測序選出大鼠腦缺血再灌注損傷后差異表達(dá)的miR133b-3p并通過qRT-PCR驗證其表達(dá)，通過雙熒光素酶靶點驗證報告證實miR133b-3p與bcl2l2的靶向調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 28只成年雄性SD大鼠250～300 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物合格證編號：SYXK桂2014- 0003。隨機(jī)均分為假手術(shù)組和腦缺血再灌注組，每組14只。每組取造模后任意12只行神經(jīng)行為學(xué)評分；5只行TTC染色；6只行qRT-PCR實驗；3只行Tunnel實驗。實驗通過廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 佳靈線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；動物麻醉機(jī)(深圳瑞沃德生物技術(shù)有限公司)；異氟烷(北京友誠生物技術(shù)有限公司)；TTC染色液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；Trizol(美國Life公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時熒光定量PCR檢測試劑盒，大鼠miR133b-3p驗證引物均為廣州復(fù)能生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Tunnel試劑盒、蛋白酶K(瑞士Roche公司)；人腎胚293T細(xì)胞(廣州銳博生物技術(shù)公司實驗室)；DMEM，胰酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；pmiR-RB-Report載體(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；分光光度計(美國Promega公司)。

1.2 腦缺血再灌注模型建立

將大鼠置于麻醉機(jī)誘導(dǎo)盒，異氟烷誘導(dǎo)麻醉3 min，期間異氟烷濃度維持在1.5%～1.8%；然后將大鼠固定于平板上，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，并且結(jié)扎頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處；在頸總動脈剪一小口，插入線栓到分叉處約18 mm，用縫線結(jié)扎血管切口，縫合皮膚；2 h后拔除線栓；腦缺血再灌注組再灌注24 h，假手術(shù)組分離肌肉組織，僅顯露血管。

1.3 動物造模的評判

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 兩組在再灌注24h后按照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：0分，無神經(jīng)行為學(xué)癥狀；1分，爪子彎曲；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能行走，無意識。

1.3.2 梗死體積測量 斷頭取腦組織于-20 ℃冷凍20 min；冠狀面切片，依次切5片，厚度約2 mm；2% TTC染液37 ℃避光孵育20～30 min；每10 min晃動切片；數(shù)碼相機(jī)拍照；用IPP6.0軟件計算梗死體積，按照文獻(xiàn)[6]，梗死體積百分率計算公式：(對側(cè)半球體積-非梗死同側(cè)半球體積)/對側(cè)半球體積×100%。

1.4 梗死中心區(qū)腦組織TUNNEL染色檢測細(xì)胞凋亡率

兩組在再灌注24 h后分別予以4%低聚甲醛灌注，取視交叉前后約2 mm腦組織；4%低聚甲醛固定24 h；石蠟包埋后切3 μm薄片；二甲苯脫蠟，5 min/次，2次；90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇脫水，各10 min；蛋白酶K 37 ℃消化30 min；PBS洗滌，玻片干后加入TUNNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次；與DAB反應(yīng)；以蘇木精染色細(xì)胞核。顯微鏡下(×100)隨機(jī)取3個視野觀察腦梗死中心區(qū)，細(xì)胞計數(shù)取平均值，陽性細(xì)胞核為棕色，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色，根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)比值計算細(xì)胞凋亡率。

1.5 實時熒光定量PCR檢測miR133b-3p表達(dá)

用Trizol從腦梗死中心區(qū)組織中提取總RNA；取1 μg在20 μL 體系中行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，85 ℃持續(xù)5 min，4 ℃保存。用逆轉(zhuǎn)錄模板行qRT-PCR反應(yīng)：95 ℃變性30 s，95 ℃變性10 s，65 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。熔融曲線分析參數(shù)： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每個PCR混合物含2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，4 μL 5×BlazeTaqqPCR混合物，0.1 μL ROX 參考染料，加無酶水至20 μL。miR133b-3p特異引物：5′-TCCCCTTCAACCAGCTAA-3′,使用5S RNA為miRNA內(nèi)參。每個樣本重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計算miR133b-3p相對表達(dá)。

1.6 miR133b-3p靶基因預(yù)測

利用靶基因數(shù)據(jù)庫(miRWalk和target scan)查找miR133b-3p對應(yīng)的與凋亡相關(guān)的靶基因。

1.7 質(zhì)粒構(gòu)建

從大鼠基因組DNA的PCR中擴(kuò)增包含miR133b-3p結(jié)合位點的bcl2l2基因的3′UTR序列，然后克隆至pmiR-RB-Report報告載體的SgfⅠ/XhoⅠ位點。使用以下引物組產(chǎn)生特異性片段：正向，5′-GCACTGCGATCGCTTCTTTTGAAGCCATCCATG-3′，反向，5′-GCGCTCGAGCCCTGAACCCCGATACATAA-3′。

1.8 雙熒光素酶分析

實驗分為2組：野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物組，野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物陰性對照組；人腎胚293T細(xì)胞于37 ℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)；取對數(shù)生長期293T細(xì)胞，以1.0×104/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)24 h；取5 μL opti-MEM稀釋miR133b-3p模擬物或陰性對照，靶基因 3′UTR雙報告基因載體或突變載體，5 μL opti-MEM稀釋 0.25 μL轉(zhuǎn)染試劑，分別靜置5 min，二者混合，輕輕搖勻，靜置 5 min；每孔加入90 μL培養(yǎng)基，再加入上述10 μL 混合液。其中，miR133b-3p模擬物轉(zhuǎn)染濃度均為 50 nmol/L，質(zhì)粒濃度為 50 ng/孔，每組設(shè) 3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染 6 h；更換培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染 48 h；每孔加入35 μL PBS和35 μL Luciferase底物，振蕩10 min，轉(zhuǎn)移至96孔板，測定熒光值。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)行為學(xué)評估和腦梗死體積比較

由圖1可見，腦缺血再灌注組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯高于假手術(shù)組(Z=-4.365，P<0.01)。肉眼觀，TTC染色顯示腦缺血再灌注組有梗死灶(白色為梗死組織)，假手術(shù)組無梗死灶。腦梗死再灌注組梗死體積百分率約為(32.42±16.3)%,見圖2。

圖1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

圖2 兩組大鼠腦組織TTC染色

2.2 腦梗死中心區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

由圖3可見，腦缺血再灌注組和假手術(shù)組大鼠腦梗死中心區(qū)均可見凋亡細(xì)胞；腦缺血再灌注組細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(t=-4.232，P<0.05)，表明腦梗死后細(xì)胞凋亡明顯。

圖3 腦梗死中心區(qū)細(xì)胞凋亡率(×100，TUNNEL染色)

2.3 miR133b-3p在腦梗死組織中的表達(dá)

由圖4可見，腦缺血再灌注組中miR133b-3p表達(dá)量較假手術(shù)組明顯降低(t=4.91，P<0.01)。

圖4 qRT-PCR檢測miR133b-3p表達(dá)量

2.4 miRNA靶基因預(yù)測與功能分析

靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miR133b-3p可能與凋亡相關(guān)的靶基因為bcl2l2。

由圖5可見，野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物組熒光強(qiáng)度明顯低于野生型bcl2l2+miR133b-3p模擬物陰性對照組(t=5.295，P<0.05)。由此表明，bcl2l2可能是miR133b-3p靶基因。

圖5 雙熒光素酶靶點驗證報告結(jié)果

3 討論

本研究顯示大鼠腦缺血再灌注損傷后miR133b-3p表達(dá)明顯降低；此外，再灌注24 h腦梗死面積明顯增大，神經(jīng)行為學(xué)評分升高，細(xì)胞凋亡數(shù)增多，提示miR133b-3p可能參與腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡。

研究表明，bcl2l2與其家族成員bcl-2功能類似，參與腫瘤發(fā)病[7]。另有研究證明，在細(xì)胞毒性條件下，bcl2l2可以抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率[8]。研究證實bcl2l2是與凋亡相關(guān)的靶基因，且與缺血性心臟病細(xì)胞凋亡相關(guān)[9]。此外，bcl2l2在腦缺血發(fā)病中發(fā)揮重要作用，過表達(dá)bcl2l2可逆轉(zhuǎn)miR-29b誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，miR-29b通過抑制bcl2l2，在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)元死亡[10]。本研究中通過生物學(xué)信息技術(shù)分析miR133b-3p可能與凋亡相關(guān)的靶基因，雙熒光素酶靶點驗證報告提示轉(zhuǎn)染miR133b-3p后，相對熒光強(qiáng)度明顯下調(diào)(P<0.05)，表明miR-133b-3p通過調(diào)控與凋亡相關(guān)的靶基因bcl2l2在腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-133b-3p是一種新的與凋亡相關(guān)調(diào)控因子，可能通過與靶基因bcl2l2結(jié)合，參與缺血性腦梗死的發(fā)生。