張雅丹,趙夢(mèng)倩,楊煜佼,徐友志,王梓郡,王焱君,許迪雅,張 琳,*,周彬彬,2,*

(1.特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室,中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖南 長沙 410117)

阿爾茲海默癥,俗稱老年癡呆,是一種神經(jīng)退行性疾病。隨著我國人口老齡化問題的加劇,老年癡呆患者的人數(shù)也在不斷增加,2050年我國老年癡呆病患者將會(huì)達(dá)到2 700萬甚至更多[1]。目前對(duì)于老年癡呆發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要集中于β淀粉樣蛋白的沉積[2]、tau蛋白的過度磷酸化[3]以及氧化應(yīng)激損傷[4]等。以Cu2+作為催化劑,催化H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激,使神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷甚至發(fā)生凋亡,這是導(dǎo)致阿爾茲海默癥的一個(gè)重要假說機(jī)制[5-6]。

鐵皮石斛是我國一種傳統(tǒng)的名貴中藥,可以清熱滋陰,生津益胃,有著豐富的藥用價(jià)值[7]。鐵皮石斛中含有大量的活性成分,如石斛堿、石斛糖類、芪類及其衍生物、多糖、氨基酸、微量元素以及多種揮發(fā)性物質(zhì)[8]等。醫(yī)學(xué)研究表明,鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤[9]、降低血糖[10]、提高免疫功能[11-12]等作用,對(duì)惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的療效。

目前鐵皮石斛多糖的提取方法主要是水提醇沉法[13]、超聲法[14]、酶提法[15]、超高壓提取法[16]、超微粉碎法[17]、閃式提取法[18]等。己有研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖具有一定的抗氧化特性,可以清除超氧陰離子自由基并且可以顯著提高小鼠肝組織及血清中谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活力,降低丙二醛含量[19]。除此之外,鐵皮石斛多糖還具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力[20],在增強(qiáng)免疫力[21]、抑制腫瘤[22]、抗癌[23]和抗衰老[24]方面有著廣泛的用途。但是鐵皮石斛多糖對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用鮮見報(bào)道。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝,并利用優(yōu)化工藝后的鐵皮石斛多糖提取物針對(duì)其抗氧化作用和對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究,探討鐵皮石斛多糖提取物對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,以期為老年癡呆癥的治療提供新的方向并為鐵皮石斛多糖的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛 深圳市源匯升生物科技有限公司;纖維素酶(酶活力1 000 U/g)、果膠酶(酶活力10 000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力50 000 U/g) 上?；鈱?shí)業(yè)有限公司;果糖、甘露糖、葡萄糖(均為食品級(jí)) 上海源葉生物科技有限公司;三氟乙酸(分析純) 上海麥克林生化科技有限公司;乙腈(分析純) 瑞典Oceanpak公司;CuSO4·5H2O、H2O2(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸(分析純) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;SH-SY5Y細(xì)胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;噻唑藍(lán)(methyl thiazoly1 tetrazolium,MTT)、香豆素-3-羧酸(coumarin-3-carboxylic acid,CCA) 美國Sigma公司;DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶(含EDTA) 美國Gibico公司;流式凋亡檢測(cè)試劑盒 美國Promege公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-522電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SB-5200超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;YRE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;722S紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DNM-9602酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;F-4600熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司;S111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司;AV52428流式細(xì)胞儀 美國Beckman公司;LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 鐵皮石斛多糖的提取

準(zhǔn)確稱取鐵皮石斛粉末0.5 g,用蒸餾水將其溶解,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為5.4,再加入一定濃度的復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶1∶1等質(zhì)量混合),40 ℃水浴2 h后,90 ℃滅酶10 min,冷卻至室溫。將所得物進(jìn)行一定時(shí)間的超聲提取,4 000 r/min離心15 min,取上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮。所得濃縮液再加入4 倍體積的95%乙醇溶液沉淀8 h,4 000 r/min離心15 min,沉淀物即為鐵皮石斛粗多糖。用30 mL蒸餾水溶解粗多糖,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0,再加入0.9 g中性蛋白酶,50 ℃水浴酶解4 h,加入氯仿-正丁醇(4∶1,V/V)的混合試劑6 mL,磁力攪拌1 h。4 000 r/min離心15 min,提取物分為3 層,去掉中間層的變形蛋白后,重復(fù)操作,直至無變形蛋白析出。將所得液體置于分液漏斗中靜置。溶液分為2 層,去除下層有機(jī)溶劑,上層即為多糖溶液[25-26]。將多糖溶液經(jīng)冷凍干燥后粉碎成粉末。

1.3.1.2 鐵皮石斛多糖得率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[27]測(cè)定多糖,準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,加入蒸餾水定容至500 mL,分別移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)液于試管中,加蒸餾水至2 mL。加入6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL,室溫放置20 min后于波長490 nm處測(cè)其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.087 9X－0.032 09(R2=0.997 8),Y為吸光度,X為多糖含量。按式(1)計(jì)算鐵皮石斛多糖得率:

1.3.1.3 單因素試驗(yàn)

料液比的確定:在超聲時(shí)間1 h、復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶1∶1等質(zhì)量混合)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%條件下,分別測(cè)定料液比為1∶30、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200(g/mL)時(shí)多糖得率;超聲時(shí)間的確定:在料液比1∶100(g/mL)、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%條件下,分別測(cè)定超聲時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)多糖得率;復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定:在料液比1∶100(g/mL)、超聲時(shí)間1.5 h條件下,分別測(cè)定復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%、50%時(shí)多糖得率。

1.3.1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn),對(duì)鐵皮石斛多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[28-29],各因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.2 鐵皮石斛多糖的組成成分分析

準(zhǔn)確稱取5 mg果糖、甘露糖、葡糖糖溶于5 mL超純水中得到單糖母液。

準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后的粉末50 mg,溶解于10 mL超純水中。分別吸取5 mL多糖溶液于2 個(gè)玻璃瓶中,其中一瓶不進(jìn)行水解,另外一瓶加入4 mol/L三氟乙酸溶液5 mL,120 ℃油浴水解2 h。用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性,未水解與水解過的多糖溶液均過0.45 μm濾膜,備用。

高效液相色譜檢測(cè)條件:氨基柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相:超純水-乙腈(75∶25,V/V);流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。蒸發(fā)光散射器條件:氮?dú)饬魉?.4 L/min,漂移管溫度95 ℃。

1.3.3 CCA熒光標(biāo)記法測(cè)定羥自由基清除率

向終濃度為6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2的溶液中加入100 μmol/L pH 7.4的CCA溶液以及pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液制成150 μL的測(cè)定液,外覆錫箔紙避光。設(shè)置激發(fā)波長390 nm,將上述測(cè)定液加入到微量比色皿中,測(cè)定其在波長450 nm處的熒光強(qiáng)度。在以上混合液中再加入10 mmol/L抗壞血酸或不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖提取物,重復(fù)測(cè)定操作。

1.3.4 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長到培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)對(duì)其進(jìn)行傳代,根據(jù)細(xì)胞的生長速率定時(shí)對(duì)其進(jìn)行換液。

1.3.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)至可傳代狀態(tài),經(jīng)胰酶消化后,取適量細(xì)胞液于血球計(jì)數(shù)板上,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,將每孔接種了2×105個(gè)細(xì)胞的96 孔板置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使其貼壁生長。吸除上述96 孔板中的培養(yǎng)基,配制一定質(zhì)量濃度梯度的鐵皮石斛多糖提取物(20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL),分別加入到96 孔板中各100 μL,同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組于同一板上,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長。吸除上述96 孔板中的藥液,配制含10% MTT的培養(yǎng)基,加入到板中各孔100 μL,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸除上述96 孔板中的藥液,各孔加入100 μL的二甲基亞砜試劑,用酶標(biāo)儀在波長492 nm處測(cè)定吸光度并記錄數(shù)值,計(jì)算得出細(xì)胞存活率,得到無毒性損傷的最大質(zhì)量濃度值。再將6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2連同10 mmol/L抗壞血酸或無損傷質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖提取物一同加入到細(xì)胞中,重復(fù)MTT比色法實(shí)驗(yàn),根據(jù)式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中:A0為空白組吸光度;A1為對(duì)照組吸光度;A2為實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.3.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡

將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)至可傳代狀態(tài),經(jīng)胰酶消化后吹打成單個(gè)細(xì)胞,向6 孔板中每孔加入0.5 mL細(xì)胞液,再加入1 mL培養(yǎng)基,置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使其貼壁生長。將上述6 孔板中的培養(yǎng)基吸掉,分別加入80 μg/mL鐵皮石斛多糖、6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++20 μg/mL鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++40 μgm/L鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++60 μg/mL鐵皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++80 μg/mL鐵皮石斛多糖溶液各1 mL,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。將6 孔板中不同處理組的SH-SY5Y細(xì)胞溶液收集到15 mL離心管中,收集好的細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,棄上清液,每管中加入1 mL的1×結(jié)合液重懸細(xì)胞,再加入4 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和4 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI),通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行,組間均數(shù)比較用單因素方差分析進(jìn)行,P＜0.05及P＜0.01均為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛提取條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響

圖1 料液比對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction yield of D. officinale polysaccharides

如圖1所示,料液比在1∶30～1∶100時(shí),多糖得率隨提取液使用量的增加而上升,這是由于當(dāng)料液比大于1∶100時(shí),蒸餾水過少導(dǎo)致鐵皮石斛多糖不能完全從物料中溶出,因此多糖得率會(huì)隨著蒸餾水的增多而增加;料液比在1∶100～1∶200時(shí),多糖得率隨著提取液使用量上升而出現(xiàn)下降趨勢(shì),這是由于溶劑的增加導(dǎo)致其對(duì)超聲波能量吸收增多,而鐵皮石斛粉末對(duì)于超聲波能量的吸收減少[30],使細(xì)胞壁不能完全破碎,多糖的溶出被抑制[31]。因此,選取1∶50、1∶100、1∶150(g/mL)作為正交試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

2.1.2 復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響

由圖2可知,在復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～50%(酶質(zhì)量占鐵皮石斛物料質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))的范圍內(nèi),隨著復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,鐵皮石斛多糖得率上升,當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%以后,得率增長趨勢(shì)變緩。這是因?yàn)樵趶?fù)合酶量小于40%時(shí),隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,酶對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞壁的破壞程度加強(qiáng),因此加快活性成分溶出細(xì)胞的速率,提高得率;但當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于40%時(shí),大部分細(xì)胞壁己經(jīng)被破壞,再加大酶量對(duì)得率的影響減小。綜合得率和成本,選取30%、40%、50%作為正交試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

圖2 復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 2 Effect of enzyme concentration on extraction yield of D. officinale polysaccharides

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)鐵皮石斛多糖得率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonication time on extraction yield of D. officinale polysaccharides

由圖3可知,在1～3 h內(nèi),隨著超聲時(shí)間的延長,鐵皮石斛多糖得率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間小于1.5 h時(shí),多糖得率的升高較為明顯,但當(dāng)超聲時(shí)間大于1.5 h時(shí),多糖得率沒有明顯增加,這是由于因分子運(yùn)動(dòng)引起的溶質(zhì)溶出己經(jīng)接近平衡[32],再延長超聲時(shí)間并不會(huì)對(duì)得率有顯著作用。綜合考慮得率和節(jié)能省時(shí)的因素,選取1、1.5、2 h作為正交試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

由表2可知,各因素對(duì)于多糖得率的影響程度為復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲時(shí)間。酶解超聲法提取鐵皮石斛總糖的最佳工藝組合為A2B3C3。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最佳工藝組合為A2B3C3平均得率為25.69%,因此,確定最佳提取條件為料液比1∶100(g/mL)、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間2 h。

2.3 鐵皮石斛多糖的單糖組成

圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）和水解后鐵皮石斛多糖提取物（B）色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards (A) and monosaccharides derived from D. officinale polysaccharides (B)

為確定鐵皮石斛多糖提取物中單糖的組成成分,以果糖、甘露糖和葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用高效液相色譜法[33]對(duì)鐵皮石斛多糖組分進(jìn)行測(cè)定。如圖4A所示,混合標(biāo)樣中3 種單糖的流出順序及保留時(shí)間分別為果糖7.678 min、甘露糖8.795 min、葡萄糖9.730 min。未水解的鐵皮石斛多糖樣品進(jìn)樣后,僅在2.5 min左右有一個(gè)大的色譜峰,其他位置并未有色譜峰出現(xiàn)。這是因?yàn)榉菃翁墙M分在糖柱中會(huì)快速被沖洗出來,在柱中并不會(huì)有保留,因此在本實(shí)驗(yàn)條件下,在未水解的鐵皮石斛多糖樣品中并未有單糖被檢出(因其色譜峰在標(biāo)樣位置并沒有峰,因此未附圖)。經(jīng)水解后的鐵皮石斛多糖中有2 種單糖被檢出,如圖4B所示,保留時(shí)間分別為8.754 min和9.687 min,因此推斷鐵皮石斛多糖中主要的單糖組成分別為甘露糖和葡萄糖。

2.4 鐵皮石斛多糖提取物對(duì)Cu2+催化H2O2產(chǎn)生羥自由基清除作用

在老年癡呆病人腦中,有過量沉積的Cu2+,其濃度高達(dá)0.4 mmol/L[34],而細(xì)胞代謝和體內(nèi)氧化還原反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一定量的H2O2[35],Cu2+可催化H2O2生成羥自由基,進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[36-37]。因此研究鐵皮石斛多糖對(duì)Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基的清除效果對(duì)于研究其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用有重要意義。如圖5所示,抗壞血酸具有一定的清除Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基的能力,但是對(duì)比鐵皮石斛多糖,10 mmol/L抗壞血酸羥自由基清除率為43.02%,而20 μg/L的鐵皮石斛多糖,羥自由基清除率達(dá)71.73%,當(dāng)繼續(xù)增加鐵皮石斛的質(zhì)量濃度時(shí),羥自由基清除率并沒有顯著變化。因此,鐵皮石斛多糖具有清除羥自由基的能力,且其能力大于抗壞血酸。

圖5 抗壞血酸和鐵皮石斛多糖提取物對(duì)H2O2/Cu2＋產(chǎn)生的羥自由基的清除作用Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging capacity of ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides

2.5 鐵皮石斛多糖提取物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

2.5.1 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

圖6 鐵皮石斛多糖提取物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig. 6 Effect of Dendrobium of ficinale polysaccharides on the viability of SH-SY5Y cells

如圖6所示,當(dāng)鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度小于80 μg/mL時(shí),基本對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響(P＞0.05);而當(dāng)鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度大于80 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率會(huì)極顯著降低(P＜0.01)。證明高質(zhì)量濃度(大于80 μg/mL)的鐵皮石斛多糖具有一定的神經(jīng)細(xì)胞毒性。這可能是因?yàn)檫^高的多糖濃度會(huì)引起細(xì)胞滲透壓的改變,從而引起細(xì)胞毒性[38]。

2.5.2 對(duì)Cu2+催化H2O2產(chǎn)生羥自由基造成的SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降的抑制作用

圖7 H2O2、Cu2＋、抗壞血酸和鐵皮石斛多糖提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig. 7 Effects of H2O2, Cu2＋, ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides,alone and in combination, on the viability of SH-SY5Y cells

如圖7所示,單獨(dú)Cu2+溶液的細(xì)胞存活率可達(dá)93.33%,單獨(dú)H2O2的細(xì)胞存活率為57.67%,H2O2/Cu2+混合溶液細(xì)胞存活率下降到43.63%,這是因?yàn)镃u2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基具有比H2O2更強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞毒性[39]。當(dāng)加入10 mmol/L抗壞血酸時(shí),細(xì)胞存活率上升至55.53%,而隨著不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖的加入,細(xì)胞存活率從60.20%上升到83.82%。證明鐵皮石斛多糖具有抑制由H2O2/Cu2+產(chǎn)生的羥自由基誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的能力,且其能力遠(yuǎn)大于抗壞血酸。

2.5.3 對(duì)Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用

圖8 鐵皮石斛多糖粗提物抑制HO/Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的22流式圖（A）和凋亡率圖（B）Fig. 8 Flow cytometric patterns (A) and apoptosis rates (B) of SH-SY5Y cells in the presence of different concentrations of D. of ficinale polysaccharides, 40 μmol/L H2O2 and 6 μmol/L Cu2＋separately and in combination

利用流式細(xì)胞法研究鐵皮石斛多糖對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用,結(jié)果如圖8所示,細(xì)胞凋亡分為早凋和晚凋,即a2+a4為細(xì)胞凋亡率。對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為15.62%,單獨(dú)H2O2處理的細(xì)胞的凋亡率為55.20%,單獨(dú)Cu2+處理的細(xì)胞的凋亡率為22.26%,H2O2/Cu2+混合溶液中細(xì)胞凋亡率為56.97%。隨著鐵皮石斛多糖的加入,在20～80 μg/mL范圍內(nèi),細(xì)胞的凋亡率隨鐵皮石斛多糖提取物質(zhì)量濃度增大而減小,由56.97%降至17.97%。證明鐵皮石斛多糖能夠有效抑制Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

3 結(jié) 論

采用酶解超聲提取法提取鐵皮石斛多糖,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的提取條件為料液比1∶100(g/mL)、超聲時(shí)間2 h、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%,此時(shí)多糖得率為25.69%。通過高效液相色譜法測(cè)得鐵皮石斛多糖中含有甘露糖和葡萄糖2 種單糖。通過羥自由基清除實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞存活率及細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn),證明鐵皮石斛多糖可以通過清除Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的羥自由基,從而有效抑制SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。