張昳馨 ， 陳楠燁， 馮美卿， 林東昉， 黃金偉， 趙 旭

喹諾酮類抗菌藥物是吡酮酸類化學合成抗菌藥物，具有4-喹諾酮結構，因其廣譜抗菌活性在臨床廣泛應用于各類感染的治療[1]。目前熟知的環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等氟喹諾酮類抗菌藥物，其結構特點為喹諾酮母核的6位均含有氟[2]。現(xiàn)已開發(fā)一系列無氟喹諾酮類新藥。奈諾沙星（nemonoxacin）作為新的無氟喹諾酮類選擇性拓撲異構酶抑制劑的代表，具有廣譜抗菌活性，對各種革蘭陽性菌和陰性菌、厭氧菌及非典型病原體均有良好抗菌活性，該藥的口服制劑已于2016年在中國大陸地區(qū)上市，適用于治療輕、中度成人社區(qū)獲得性肺炎[3-4]。

近年來國內外研究顯示，氟喹諾酮類抗菌藥物對宿主的非特異性及特異性免疫均有調控作用[5-6]。如莫西沙星對脂多糖（LPS）刺激單核巨噬細胞產生白細胞介素（IL）-8、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β等均有抑制作用[7]。本課題組前期研究表明，奈諾沙星在體外和體內試驗中均顯示對LPS誘導的炎性反應具有免疫調節(jié)作用，表現(xiàn)為抑制促炎因子IL-6、TNF-α分泌，促進抑炎因子IL-10分泌，從而抑制宿主產生過度免疫反應，對宿主具有一定保護作用。同時奈諾沙星能顯著降低高劑量LPS引起嚴重內毒素血癥小鼠的死亡率[8]。在此基礎上，本課題組采用流式細胞技術研究奈諾沙星對LPS誘導的小鼠內毒素血癥模型中脾臟免疫細胞的影響；研究奈諾沙星對巨噬細胞吞噬功能的免疫調控作用；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測奈諾沙星對LPS誘導巨噬細胞分泌細胞因子的作用；采用免疫印跡試驗（Western blot）方法檢測奈諾沙星對細胞因子相關信號轉導通路的調控作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 RAW264.7細胞，屬小鼠單核巨噬細胞系，購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.2 試劑 奈諾沙星標準品由浙江醫(yī)藥股份有限公司提供；流式細胞技術所用抗體anti-CD16/anti-D32、太平洋藍-PE、異硫氰酸熒光素（FITC）、別藻藍蛋白（APC）等熒光標記的CD11b、CD11c、 F4/80、 Ly6G結合抗體購自美國Bio-Rad公司；DMEM培養(yǎng)液（高糖）購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素雙抗、LPS、二甲基亞砜（DMSO）、細胞裂解液RIPA緩沖液購自美國Sigma公司；類胎牛血清購自美國HyClone公司；96孔ELISA試劑盒購自美國Bio-Rad公司；用于Western blot的10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺膠、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、吐溫20、TBS緩沖液均購自美國Sigma公司。二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、化學發(fā)光試劑ECL prime顯色溶液均購自美國Bio-Rad公司，p38 MAPK抗體、ERK1/2抗體、p-JNK抗體、p-100抗體（1∶1 000 稀釋）及對照β-actin抗體購自美國R&D公司。

1.1.3 實驗動物 C57BL/C小鼠，鼠齡8～10周，體質量20～25 g，雄性，合格證號為SCXK（滬）：2017-0002，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，相對濕度50%～70%，本研究使用15只。

1.1.4 菌株 進行巨噬細胞吞噬試驗的菌株為華山醫(yī)院臨床分離菌株肺炎克雷伯菌18-218，來源于1例呼吸機相關性肺炎患者的肺泡灌洗液，奈諾沙星對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）為32 mg/ L。

1.1.5 儀器與軟件 LSR II流式細胞儀為BD公司產品；流式細胞結果分析采用美國TreeStar公司FlowJo軟件。Western blot凝膠成像采用美國Bio-Rad公司凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞技術檢測奈諾沙星對小鼠脾臟免疫細胞的作用

1.2.1.1 LPS誘導小鼠內毒素血癥、奈諾沙星干預及分離小鼠脾臟免疫細胞 15只小鼠隨機分為3組，每組5只：組1為正常對照組；組2為LPS組，在實驗當日每只小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS 200 μL，2 h后腹腔注射0.9%NaCl溶液200 μL；組3為LPS+奈諾沙星組，每只小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS 200 μL，2 h后腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg。6 h后統(tǒng)一處死3組小鼠。解剖小鼠，取出小鼠脾臟，迅速浸泡在PBS緩沖液中，用注射器的活塞研磨成單細胞，并通過尼龍網(wǎng)過濾成單細胞懸液。在4 ℃下300～400 g離心4～5 min，除去上清液，最后加入紅細胞裂解液1 mL裂解紅細胞，作為小鼠脾臟細胞懸液。

1.2.1.2 流式細胞技術檢測小鼠脾臟巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的絕對計數(shù) 取上述3組小鼠脾臟細胞懸液20 μL，加入PBS緩沖液380 μL，采用細胞計數(shù)板在電子顯微鏡下計數(shù)。在每個流式檢測管分別加入50 μL細胞懸液（稀釋到約106/ mL），并輕輕混勻，加入10 mg/L的封閉抗體anti-CD16/CD32，封閉10 min，再加入帶有太平洋藍-PE、FITC、APC等熒光標記的CD11b、CD11c、 F4/80、 Ly6G結合抗體冰浴下染色孵育20 min。孵育完成后，加入FACS緩沖液（每流式檢測管中加2 mL） 4 ℃下300～400 g離心5 min，棄去上清液，重復洗滌過程3次，重懸細胞后上流式細胞儀檢測。數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件分析。采用流式細胞技術檢測小鼠脾臟髓樣細胞亞群如巨噬細胞[CD11b (+)、CD11c (-)、F4/80 (+)]、中性粒細胞[CD11b (+)、CD11c (-)、Ly6G (+)]和樹突狀細胞[CD11c (+)]等細胞的絕對計數(shù)，之后對3組小鼠進行比較。

1.2.2 巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)與吞噬肺炎克雷伯菌試驗 自-80 ℃冰箱中取出RAW264.7細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素雙抗），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育至生長約80%傳代，取4～5 代生長狀態(tài)良好的細胞，以約105/mL的密度接種于24孔板中培育至約80%進行巨噬細胞吞噬肺炎克雷伯菌試驗。在實驗當天吸去細胞培養(yǎng)基隨即放入新鮮的無血清DMEM高糖培養(yǎng)液后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、肺炎克雷伯菌進行孵育。實驗分為2組：組1為奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組，先將800 mg/L奈諾沙星溶液10 μL加入1 mL細胞培養(yǎng)基（奈諾沙星用無菌蒸餾水配制，奈諾沙星終濃度為8 mg/L），2 h后再加入3×108CFU/mL的肺炎克雷伯菌菌液10 μL（肺炎克雷伯菌終濃度為3×106CFU/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；組2為肺炎克雷伯菌對照組，不加奈諾沙星，但與組1同時加入肺炎克雷伯菌菌液。加入菌液后巨噬細胞吞噬2 h，接著吸取上清液，并用PBS多次清洗，收集所有上清液，經稀釋涂LB平皿，培養(yǎng)過夜后LB平皿菌落計數(shù)，統(tǒng)計胞外菌數(shù)量；另外此24孔板中每孔再次加入無菌蒸餾水1 mL，由于滲透壓不同，巨噬細胞會裂解并釋放出吞噬的肺炎克雷伯菌，故裂解細胞2 h后收集所有上清液，經稀釋涂LB平皿，培養(yǎng)過夜后再次行LB平皿菌落計數(shù)，研究奈諾沙星干預后RAW264.7細胞吞噬肺炎克雷伯菌差異。

1.2.3 奈諾沙星對LPS誘導巨噬細胞分泌細胞因子的相關信號轉導通路試驗 同1.2.2方法培養(yǎng)RAW264.7細胞，以5×105/mL的密度接種于12孔板中培育至約80%進行LPS誘導炎性反應。在實驗當天吸去細胞培養(yǎng)基隨即放入新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、LPS進行孵育。實驗分為3組：組1為奈諾沙星+LPS組，先將400 mg/L的奈諾沙星溶液20 μL加入2 mL細胞培養(yǎng)基（奈諾沙星用無菌蒸餾水配制，奈諾沙星終濃度為4 mg/L），2 h后再加入1 mg/ L的LPS 20 μL（LPS終濃度為10 μg/L）繼續(xù)培養(yǎng)；組2為LPS組，不加奈諾沙星，但與組1同時加入LPS；組3為空白對照組，不加奈諾沙星和LPS。巨噬細胞裂解液抽提蛋白后，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定的蛋白濃度。取出部分蛋白，加入RIPA緩沖液和SDS，制備成20 μL備孔的蛋白樣品，100 ℃加熱10 min后冰浴，接著點樣至10% SDS聚丙烯酰胺膠，經電泳及電轉膜后，蛋白轉移至PVDF膜上，PVDF膜采用含5%無脂牛奶的TBST（含0.1%吐溫的TBS溶液）封閉1 h，后采用TBST溶液洗滌3次，與磷酸化p38 MAPK抗體 （p-p38抗體，1∶2 000 稀釋）、磷酸化 ERK1/2抗體 （p-ERK1/2抗體，1∶2 000稀釋）、磷酸化JNK1抗體（p-JNK1抗體，1∶1 000稀釋）、p-100抗體（1∶1 000 稀釋）、對照為β-actin抗體在4 ℃共孵育過夜。采用TBST洗滌3次，加入二抗后室溫振搖2 h后，再次采用TBST洗滌3次，每張膜加入ECL prime顯色溶液，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測相關條帶。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5.0 進行作圖和分析。實驗數(shù)據(jù)計量資料均以均數(shù)±標準差表示，兩組之間計量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 奈諾沙星對小鼠脾臟免疫細胞數(shù)量的調控作用

采用LPS（5 mg/kg）誘導小鼠內毒素血癥，通過電子顯微鏡計數(shù)正常對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組3組小鼠的脾臟免疫細胞，圖1A示流式細胞分選過程，結果顯示3組小鼠脾臟免疫細胞總數(shù)不同（圖1B），正常對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組小鼠的脾臟免疫細胞總數(shù)分別為（1.84±0.13）×108/L、（6.40±1.06）×108/L 、（2.87±0.25）×108/L，即LPS組小鼠脾臟免疫細胞數(shù)最高，平均值是正常小鼠的3.5倍，LPS+奈諾沙星組小鼠免疫細胞均值也較正常小鼠高，是正常小鼠的1.6倍，但明顯低于LPS組（降低55.1%），LPS組與LPS+奈諾沙星組的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012），提示LPS能引起小鼠炎性反應，小鼠脾臟內免疫細胞數(shù)量明顯增多，而奈諾沙星可以抑制免疫細胞的數(shù)量增多，即抑制炎性反應。圖1C示3組小鼠脾臟中巨噬細胞數(shù)量，結果顯示對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組小鼠脾臟巨噬細胞數(shù)量分別為（5.47±0.15）×105/L、（3.25±0.68）×106/L、（1.20±0.06）×106/L，

LPS組巨噬細胞數(shù)量仍為最高，均數(shù)值是正常小鼠的5.9倍，LPS+奈諾沙星組小鼠巨噬細胞數(shù)量均值較正常小鼠有升高，是正常小鼠的2.2倍，但明顯低于LPS組（降低63.1%），LPS組與LPS+奈諾沙星組組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017）。圖1D示3組小鼠中性粒細胞數(shù)量，對照組、LPS組和LPS+奈諾沙星組分別為（6.67±0.11）×105/ L、（5.46±1.77）×106/ L和（5.13±0.96）×106/L， LPS與LPS+奈諾沙星兩組小鼠中性粒細胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義。圖1E示3組小鼠樹突狀細胞數(shù)量，對照組、LPS組和LPS+奈諾沙星組分別為（4.86±0.11）×106/L、（2.76±1.20）×107/ L和（9.36±1.63）×106/L， LPS+奈諾沙星組小鼠樹突狀細胞均值較LPS組也明顯降低（降低66.1%），且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01），這一結果提示當LPS引起小鼠炎性反應時，小鼠脾臟中的各種免疫細胞數(shù)量會明顯上升，而奈諾沙星對于小鼠脾臟中免疫細胞數(shù)量增加有明顯抑制作用，且奈諾沙星的抑制作用有特異性，主要作用于巨噬細胞和樹突狀細胞，對中性粒細胞基本無抑制作用。

圖1 流式細胞技術檢測小鼠脾臟免疫細胞數(shù)量Figure 1 Population of immune cells in spleen by flow cytometry

2.2 奈諾沙星對巨噬細胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌的影響

巨噬細胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌試驗中，加入無菌蒸餾水后2 h由于滲透壓不同，巨噬細胞會裂解并釋放出吞噬的肺炎克雷伯菌，檢測有無奈諾沙星干預的兩組胞內菌菌落計數(shù)，各組均檢測了6個巨噬細胞樣本，結果如圖2所示。其中奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組胞內菌計數(shù)為（4.12±2.10）×103CFU/mL，而肺炎克雷伯菌組胞內菌計數(shù)為（2.08±1.09）×103CFU/mL，奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組菌落計數(shù)均數(shù)是肺炎克雷伯菌組的2.0倍，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.047），結果顯示當奈諾沙星存在時，巨噬細胞RAW264.7吞噬入胞內的肺炎克雷伯菌數(shù)量增加1.0倍，提示奈諾沙星可以提高巨噬細胞的細菌吞噬能力。

圖2 奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組和肺炎克雷伯菌組巨噬細胞吞噬細菌計數(shù)Figure 2 Count of the bacteria engulfed by macrophages after treatment with nemonoxacin + K. pneumoniae or K. pneumoniae alone

2.3 奈諾沙星對LPS誘導巨噬細胞分泌細胞因子的信號轉導通路調控作用

采用Western blot方法研究奈諾沙星對IL-6、TNF-α的抑制作用主要依賴于MAPK還是NF-κB信號轉導通路途徑，結果見圖3。本試驗采用LPS誘導巨噬細胞炎性反應模型，加以奈諾沙星干預后，檢測MAPK通路的p-p38 MAPK、p-JNK1、ERK1/2，NF-κB信號轉導通路的p-100蛋白表達水平。Western blot結果顯示對于p-p38 MAPK的表達，在LPS作用后3 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-p38 MAPK表達水平類似，而在LPS作用后6 h，LPS組表達水平明顯較LPS+奈諾沙星為強，在12 h兩組又基本相同；對于p-JNK1，LPS作用后3 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-JNK1表達水平類似，而在LPS作用后6 h，LPS組表達水平明顯較LPS+奈諾沙星為強，在12 h，LPS組較LPS+奈諾沙星組p-JNK1表達水平仍高，但兩組差異變??；對于MAPK通路的另一家族成員ERK1/2，LPS作用后3、6、12 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組ERK1/2的表達水平基本相同；檢測 NF-κB其p-52亞基的前體形式p-100，LPS作用后3、6、12 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-100的表達水平基本相同。提示奈諾沙星對IL-6、TNF-α的抑制作用主要還是依賴于MAPK信號轉導通路途徑，奈諾沙星可能通過抑制p-p38 MAPK、p-JNK1的表達，進而抑制IL-6等促炎性細胞因子的表達，從而抑制LPS誘導巨噬細胞的炎性反應。奈諾沙星在LPS誘導巨噬細胞炎性反應時，抑制NF-κB表達的作用不強，推測NF-κB不是奈諾沙星抑制巨噬細胞炎性反應依賴的信號轉導通路途徑。

圖3 Western blot方法檢測信號轉導通路Figure 3 Western blot assay of signal transduction pathways

3 討論

奈諾沙星是一種新型無氟喹諾酮類抗菌藥物，具有良好的抗菌活性，在臨床上得以廣泛應用[9]。本課題組前期的研究已經發(fā)現(xiàn)，奈諾沙星具有一定的免疫介導作用，體內、體外試驗均顯示奈諾沙星對LPS誘導的炎性反應有抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌，促進IL-10等抑炎因子的分泌；并且奈諾沙星能降低LPS誘導的內毒素血癥小鼠的病死率，保護作用達60%[8]。但以上前期實驗僅僅是研究奈諾沙星免疫調控作用的初步試驗，即藥物對細胞因子的作用。但奈諾沙星是否對巨噬細胞、中性粒細胞具有特異性免疫抑制作用，是否能增強巨噬細胞的吞噬能力，以及奈諾沙星抑制IL-6等促炎細胞因子是否依賴于MAPK或NF-κB信號轉導通路途徑未見相關研究報道，課題組就以上問題進行了深入研究。

本研究采用流式細胞技術檢測LPS組和LPS+奈諾沙星組小鼠脾臟髓樣細胞亞群，結果發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射LPS后，會誘導炎性反應，處死小鼠后分離小鼠脾臟免疫細胞，可以看到無論免疫細胞總量、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞都較正常小鼠有明顯上升，達到正常小鼠的3.6～8.2倍，而LPS+奈諾沙星組以上免疫細胞數(shù)量較正常小鼠有所上升，但免疫細胞總量、巨噬細胞和樹突狀細胞數(shù)量較LPS組有明顯降低，其中免疫細胞總量下降55.1%，巨噬細胞數(shù)量下降63.1%，樹突狀細胞數(shù)量下降66.1%，而中性粒細胞數(shù)量兩組相仿，無明顯差異。這一結果提示奈諾沙星能夠抑制LPS誘導小鼠的炎性反應，且能夠抑制小鼠脾臟中與炎性相關的免疫細胞數(shù)量上升，但此種免疫抑制作用有特異性，即奈諾沙星特異性地抑制小鼠脾臟中巨噬細胞和樹突狀細胞的數(shù)量，而對中性粒細胞基本無抑制作用，但奈諾沙星的抑制作用是抑制髓樣細胞亞群的增殖還是減少趨化因子的分泌、抑制免疫細胞在脾臟等炎癥部位的聚集需要進一步研究證實。

本研究通過體外試驗檢測了奈諾沙星對巨噬細胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌功能的影響，結果顯示8 mg/L奈諾沙星可以提高巨噬細胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌的能力，加入奈諾沙星2 h后，巨噬細胞吞噬入胞內的肺炎克雷伯菌數(shù)量增加1.0倍，這一結果提示奈諾沙星可提高巨噬細胞的吞噬能力。其他氟喹諾酮類藥物也有類似的研究結果，如采用0.5 MIC加替沙星對小鼠腹腔巨噬細胞預處理，該藥能顯著增強巨噬細胞的吞噬并提高細胞內殺菌能力。半體內試驗即小鼠靜脈給加替沙星20 mg/kg，收集腹腔巨噬細胞體外測定對細菌的吞噬作用，結果表明也有增強作用 [10]。

本課題組既往研究結果提示奈諾沙星對LPS誘導的炎性反應有抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6的分泌[8]，相關研究顯示與IL-6相關的信號轉導通路主要為LPS與炎性細胞表面受體結合后，通過Toll樣受體4（TLR4），激活IL-1受體連接的蛋白激酶（IRAK），從而激活MAPK或NF-κB信號轉導通路[11-12]，其中MAPK信號轉導通路又包括ERK、JNK和p-38 MAPK等蛋白[13]。本研究仍采用LPS誘導巨噬細胞炎性反應，通過Western blot方法檢測奈諾沙星+LPS及LPS組 ERK、JNK、p-38 MAPK以及NF-κB等蛋白的表達，結果顯示奈諾沙星主要抑制p-p38 MAPK、p-JNK的表達，對JNK及NF-κB抑制作用不強，推測p-p38 MAPK、p-JNK是奈諾沙星抑制LPS誘導的炎性反應主要依賴的信號轉導通路途徑而非NF-κB。國外相關報道顯示其他氟喹諾酮類抗菌藥物對信號轉導通路的調控作用與奈諾沙星不同[14]，如莫西沙星既通過抑制NF-κB的活性起到抗炎效應，也能抑制LPS刺激后引起的ERKl/2、p-JNKl/2的活性增強[15]，這與奈諾沙星明顯不同。

以上研究結果是在前期研究基礎上更加深入地研究了奈諾沙星的免疫調控作用機制，結果提示奈諾沙星能夠抑制小鼠脾臟中與炎性相關的免疫細胞數(shù)量上升，同時可以顯著提高巨噬細胞對細菌的吞噬功能，這將可能有助于重癥感染性疾病患者免疫功能的改善，并提高疾病治療的有效率和治愈率，降低宿主的病死率。應在動物實驗及臨床研究中進一步驗證奈諾沙星對感染炎性反應的免疫調節(jié)作用的獲益。