劉 薔， 楊 萍， 盧 明， 陳代杰

L型細(xì)菌是一種細(xì)菌細(xì)胞壁形成受到抑制的特殊生長(zhǎng)形式，可在體內(nèi)自發(fā)形成。本綜述主要闡述L型細(xì)菌與感染及其耐藥機(jī)制。

1 L型細(xì)菌與感染

L型細(xì)菌的基本形狀是球形的，但具有高度的可塑性，可在周?chē)h(huán)境的影響下呈現(xiàn)出一系列不規(guī)則的形狀。L型細(xì)菌在1935年由Klieneberger[1]在研究桿狀革蘭陰性菌莫尼鏈球菌時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，并以其當(dāng)時(shí)工作的李斯特菌研究所（Lister Institute）命名[2]。

許多細(xì)菌都能形成L型，如枯草芽孢桿菌、博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）[3]等。自20世紀(jì)40年代起，L型細(xì)菌與一系列傳染病的聯(lián)系已有大量研究[4-6]，大多數(shù)研究主要集中于泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。不少文獻(xiàn)也報(bào)道了呼吸道、胃腸道、表皮和生殖系統(tǒng)感染。

人腎髓質(zhì)呈高滲生理環(huán)境[7]。此外，在泌尿系統(tǒng)細(xì)菌感染的患者中，尿液的滲透壓通常高于健康人[8]。因此，許多研究集中于L型細(xì)菌在復(fù)發(fā)性尿路感染（urinary tract infection， rUTI）中的重要性及導(dǎo)致疾病的可能性。

根據(jù)L型細(xì)菌可通過(guò)0.45 mm濾過(guò)器，而有壁細(xì)菌無(wú)法濾過(guò)的原理，研究者可從尿液或腎臟中分離出兩種L型細(xì)菌，將過(guò)濾后的樣品接種于有或無(wú)滲透保護(hù)的培養(yǎng)基中，并進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)。采用這種方法，20世紀(jì)60年代的研究者們從泌尿系統(tǒng)感染患者中成功分離出L型細(xì)菌[9-12]。

Domingue[4]綜述了20世紀(jì)60－80年代一系列的研究，這些研究通過(guò)顯微鏡方法對(duì)患有腎臟疾病和尿路感染患者的尿液和血液中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)。利用人類(lèi)胚胎腎成纖維細(xì)胞（HEK）和感染大腸埃希菌、奇異變形桿菌或大腸埃希菌L型的無(wú)菌動(dòng)物，研究L型細(xì)菌在宿主組織中的存活能力，提出宿主細(xì)胞中小的、電子密度高的、非泡狀的形式是細(xì)菌持留性的關(guān)鍵所在。Wittler等[13]在使用抗生素治療的亞急性心內(nèi)膜炎患者的血液中也檢測(cè)到小顆粒狀的形式。顆粒在滲透保護(hù)介質(zhì)中呈L型生長(zhǎng)，隨后又回復(fù)到有壁桿菌。Almenoff等[14]從20例結(jié)節(jié)病患者中19例的血液標(biāo)本中分離出L型結(jié)核分枝桿菌，而健康對(duì)照組的血液中沒(méi)有生長(zhǎng)。對(duì)慢性葡萄球菌感染、布魯菌病以及A群鏈球菌引起的風(fēng)濕熱患者進(jìn)行了相似的研究 [15- 19]。

20世紀(jì)早期的科學(xué)研究表明，引起rUTI的細(xì)菌可以通過(guò)采取細(xì)胞壁缺陷型或L型狀態(tài)幸存于細(xì)胞壁特異性抗生素的治療中。但由于缺乏分子診斷工具，這些研究難以令人信服[20]。而且，由于常規(guī)的微生物培養(yǎng)基是低滲的，并且不支持L型生長(zhǎng)，因此L型細(xì)菌在臨床中幾乎被完全忽略。近期Mickiewicz等[21]發(fā)現(xiàn)在30例rUTI老年患者中29例的新鮮尿液中存在L型細(xì)菌。從rUTI患者中分離出的L 型細(xì)菌可以在有磷霉素的情況下在尿液中存活，并且在停用抗生素后能夠再生其細(xì)胞壁。同樣在斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)感染模型中也能發(fā)現(xiàn)同樣的轉(zhuǎn)換。Rojas等[22]發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性細(xì)菌外膜對(duì)細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性起了重要作用，這也許可以解釋為何L型細(xì)菌可在尿液中存活。

Beaman等[23-28]報(bào)道L型諾卡菌在疾病中可能的作用，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)小鼠模型中的L型諾卡菌是從有壁細(xì)菌轉(zhuǎn)變而來(lái)。L型參與了持留性以及慢性肌瘤特征性顆粒的發(fā)展。有趣的是，L型細(xì)菌僅在免疫功能強(qiáng)的小鼠身上觀察到，而免疫系統(tǒng)不全（無(wú)脾無(wú)胸腺）的小鼠則不能檢測(cè)到，這表明體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)L型細(xì)菌有誘導(dǎo)作用。此外，他們成功地使用滲透保護(hù)型培養(yǎng)基從1例后來(lái)死于腦膿腫患者的腦脊液中分離出了多個(gè)L型細(xì)菌。且重要的是在無(wú)滲透保護(hù)的情況下培養(yǎng)時(shí)，并沒(méi)有觀察到任何細(xì)菌生長(zhǎng)，提示L型是患者腦脊液中諾卡菌的主要或唯一的變異。其他研究也在尋找L型細(xì)菌與中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性感染之間的聯(lián)系，但結(jié)果并沒(méi)有定 論。

Zhang等[29]對(duì)62例合并糖尿病的結(jié)核病痰涂片陽(yáng)性患者和89例非糖尿病結(jié)核病患者進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)在這62例研究對(duì)象中，46.77%結(jié)核分枝桿菌L（MTB-L）型呈陽(yáng)性。糖尿病合并肺結(jié)核患者的耐藥性明顯高于單純肺結(jié)核患者，因此在確定結(jié)核病治愈的細(xì)菌學(xué)證據(jù)時(shí)，應(yīng)更嚴(yán)格地測(cè)試MTB-L型涂片染色檢查。

Akimoto等[30]在結(jié)節(jié)病患者Hamazaki-Wesenberg淋巴結(jié)中檢測(cè)到L型痤瘡丙酸桿菌。這可能是首次在結(jié)節(jié)病組織中證實(shí)的痤瘡丙酸桿菌L型感染病例報(bào)告，結(jié)節(jié)病組織發(fā)展為孤立性肉芽腫性厚腦膜炎。該研究提示，用PCR方法定量檢測(cè)血液或腦脊液中痤瘡丙酸桿菌的DNA有助于孤立性神經(jīng)瘤樣病變的診斷，而用抗生素二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素治療是有效的。

L型細(xì)菌雖然與許多感染相關(guān)，但Schnell等[31]發(fā)現(xiàn)雖然未激活的巨噬細(xì)胞會(huì)使L型李斯特菌持留，但可以通過(guò)預(yù)激活干擾素（IFN）-γ或骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMM）有效地消除細(xì)菌。缺乏IFN-β觸發(fā)表明L型細(xì)菌無(wú)法從巨噬細(xì)胞逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明由于毒力因子的表達(dá)減少和先天免疫識(shí)別，L型李斯特菌的致病性會(huì)大大減 弱。

2 L型細(xì)菌的耐藥機(jī)制

2.1 L型細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的改變與抗生素耐受

在體外，L型細(xì)菌形成困難，會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生活性氧（ROS）而致死。Kawai等[32]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)L型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與中心碳代謝相關(guān)。缺乏細(xì)胞壁或用β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素阻止其合成，會(huì)導(dǎo)致糖酵解的通量增加，導(dǎo)致呼吸鏈中產(chǎn)生活性氧，阻止了L型細(xì)菌的生長(zhǎng)。通過(guò)減慢糖酵解，激活糖異生或消耗氧氣來(lái)補(bǔ)償代謝失衡，可使L型枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，而這些作用在缺乏呼吸鏈途徑的糞腸球菌中則不會(huì)發(fā)生。

L型細(xì)菌細(xì)胞壁的缺失會(huì)使其對(duì)細(xì)胞壁靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。事實(shí)上，細(xì)胞壁靶向抗生素甚至促進(jìn)了有壁細(xì)胞向L型細(xì)菌的轉(zhuǎn)變[32]。例如，在滲透壓平衡的條件下，大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌中通?？梢苑乐功聝?nèi)酰胺類(lèi)抗生素引發(fā)的災(zāi)難性鼓脹和細(xì)胞死亡，這些細(xì)菌傾向于失去其肽聚糖層，因此采用球形形態(tài)，即原生質(zhì)球形態(tài)[33-34]。原生質(zhì)球由于承受壓力的外膜而保持完整[22，35]。研究顯示，在包括銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌和克雷伯菌在內(nèi)的一系列致病菌中都觀察到了這一現(xiàn)象[33-34]。用美羅培南（5 MIC）處理銅綠假單胞菌PA14菌株后，Monahan等[33]發(fā)現(xiàn)整個(gè)種群從正常桿狀細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的球形細(xì)胞，在24 h內(nèi)整個(gè)種群僅由球形細(xì)胞組成。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（MH培養(yǎng)基）及與感染和體內(nèi)環(huán)境有關(guān)的條件（合成痰液和胎牛血清）下，均能觀察到此現(xiàn)象。用透射電鏡（TEM）觀察到球形細(xì)胞的細(xì)胞壁被破壞，表明當(dāng)用靶向細(xì)胞壁的抗生素攻擊時(shí)，銅綠假單胞菌可以轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型，且此過(guò)程為可逆過(guò)程，去除抗生素壓力后，L型可轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓉?lái)的有壁細(xì)胞狀態(tài)。

Slavchev等[36]在體外通過(guò)低溫應(yīng)激處理產(chǎn)生MTB-L型。低溫脅迫處理后，使用Canetti絕對(duì)濃縮法對(duì)表型進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估了親本菌株及其L型培養(yǎng)物對(duì)乙胺丁醇的敏感性，并通過(guò)PCR-RFLP分析針對(duì)embB306基因突變的分段。與對(duì)乙胺丁醇（2 mg/L）敏感的親本菌株相比，其L型表現(xiàn)出對(duì)高濃度乙胺丁醇（16 mg / L）的抗性。值得注意的是，在L型變異體中未發(fā)現(xiàn)embB306突變。此外，通過(guò)擴(kuò)增和測(cè)序16S rRNA基因片段，親本菌株和L型均無(wú)遺傳差異。在測(cè)試的特定位點(diǎn)，L型變異體缺乏遺傳變化，這促使它們通過(guò)展示非特異性防御機(jī)制和形成L型獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)尋求其對(duì)乙胺丁醇的表型耐藥性的解釋。他們觀察到，在壓力下，結(jié)核分枝桿菌會(huì)發(fā)生劇烈的形態(tài)和功能變化，導(dǎo)致L型轉(zhuǎn)化。TEM和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)壁分離的碎片和無(wú)定形物質(zhì)圍繞著細(xì)胞呈膠囊狀物質(zhì)分布，使球形L體或球狀L型細(xì)胞的微菌落位于豐富的生物膜樣基質(zhì)中。Slavchev等[36]認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇的耐藥表型可能與L型細(xì)菌細(xì)胞壁的改變或丟失有關(guān)，從而導(dǎo)致乙胺丁醇對(duì)其作用缺乏明確的靶點(diǎn)。L型細(xì)菌產(chǎn)生的膠囊狀結(jié)構(gòu)和生物膜基質(zhì)有助于其在抗菌藥物存在下的耐藥性和存活率。這兩種物質(zhì)會(huì)完全包圍L型細(xì)菌，起到屏障的作用來(lái)阻止抗生素的滲透。在無(wú)法殺死細(xì)胞壁缺陷L型細(xì)菌的情況下，抗結(jié)核治療無(wú)效。

2.2 L型細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的改變與免疫逃逸

最近的證據(jù)已經(jīng)明確證明革蘭陽(yáng)性細(xì)菌可以在哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞內(nèi)的β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物治療中存活，它們通過(guò)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型來(lái)實(shí)現(xiàn)，L型是由宿主裂解酶（例如溶菌酶）的活性刺激的過(guò)程。這不僅在巨噬細(xì)胞中觀察到，而且能在動(dòng)物模型中觀察到[32]。Kawai等[32]用枯草芽孢桿菌感染蠟螟（Galleria mellonella）的幼蟲(chóng)（該模型具有先天免疫系統(tǒng)，其中包含與人類(lèi)巨噬細(xì)胞類(lèi)似的吞噬細(xì)胞，是一種使用越來(lái)越廣泛的簡(jiǎn)單動(dòng)物模型）時(shí)，能觀察到在血淋巴中懸浮著許多球形枯草芽孢桿菌細(xì)胞。他們認(rèn)為幼蟲(chóng)吞噬細(xì)胞會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞狀態(tài)，這可能是由于幼蟲(chóng)產(chǎn)生分解酶的作用而產(chǎn)生的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證猜想，他們將經(jīng)過(guò)細(xì)菌感染的血淋巴涂在含有青霉素G的等滲瓊脂上，對(duì)照組為血淋巴相同孵育條件下但無(wú)細(xì)菌感染。結(jié)果如預(yù)期，在孵育2 d后，對(duì)照組未出現(xiàn)菌落，而實(shí)驗(yàn)組觀察到大量枯草芽孢桿菌的L型菌落，用金黃色葡萄球菌也獲得類(lèi)似的結(jié)果?；谶@些結(jié)果，研究者認(rèn)為宿主環(huán)境中的免疫效應(yīng)物（可能包括溶菌酶）可以驅(qū)動(dòng)L型轉(zhuǎn)變，從而有助于對(duì)β 內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐受。

細(xì)胞壁缺陷細(xì)胞的可延展?fàn)顟B(tài)甚至可能通過(guò)有壁細(xì)胞難以通過(guò)的孔洞促進(jìn)菌體細(xì)胞在宿主內(nèi)的擴(kuò)散。由于它們?nèi)狈εc病原體相關(guān)的模式識(shí)別受體識(shí)別的各種分子，尤其是磷壁酸和肽聚糖[37-38]，因此先天免疫系統(tǒng)不易檢測(cè)到細(xì)胞壁缺陷形式。因此，細(xì)胞壁缺陷也可以使細(xì)菌在對(duì)壁靶向抗生素不敏感的狀態(tài)下逃脫先天免疫殺傷。至關(guān)重要的是，在抗生素治療終止后，這些細(xì)菌（特別是革蘭陰性細(xì)菌）可以有效地恢復(fù)到其有壁狀態(tài)，并重新導(dǎo)致宿主感染[20，39]。

3 小結(jié)

L型細(xì)菌是一種細(xì)菌細(xì)胞壁形成受到抑制的特殊的生長(zhǎng)形式，可在體內(nèi)自發(fā)形成。見(jiàn)圖1。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其在rUTI等感染中起著重要作用。由于細(xì)胞壁缺失以及隨之帶來(lái)的表面抗原減少，L型細(xì)菌可逃避壁靶向類(lèi)抗生素以及巨噬細(xì)胞殺傷，產(chǎn)生抗生素耐受以及免疫逃逸現(xiàn)象，給臨床治療帶來(lái)不小的挑戰(zhàn)。將靶向細(xì)胞壁的抗生素與其他類(lèi)別的抗生素（例如針對(duì)細(xì)菌膜的抗生素）組合使用可能是臨床治療細(xì)菌感染的新方向。

圖1 L型細(xì)菌感染及免疫逃逸與抗生素耐藥關(guān)系