邢榮娥 , 秦玉坤 , 李克成 , 劉 松 , 李鵬程

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東青島 266071)

甲殼素(chitin)又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì), 其化學(xué)名稱為 β-(1→4)-2-N-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖, 分子式為(C6H13NO5)n, 結(jié)構(gòu)如圖1。甲殼素廣泛存在于自然界中, 如甲殼動物外殼、真菌的細胞壁以及昆蟲的外殼等, 每年生物合成量約為 100億噸[1], 是繼纖維素后的第二大可再生生物合成資源, 在水產(chǎn)加工副產(chǎn)物中的含量甚豐, 如在蝦、蟹殼中的含量可達15%～30%。甲殼素不溶于水、乙醇等有機溶劑以及稀酸和稀堿, 可溶于濃無機酸, 但在溶解過程中主鏈發(fā)生降解, 乙酰基發(fā)生脫除, 分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。殼聚糖, 又叫幾丁聚糖, 是甲殼素的脫乙酰基的產(chǎn)物, 脫乙酰度通常在 50%～100%, 化學(xué)名為β-(1→4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖, 由于甲殼素分子中二位乙?；拿摮? 其分子式為(C5H11NO5)n, 結(jié)構(gòu)如圖1。殼聚糖隨著乙?；康臏p少或游離氨基含量的增加, 溶解性得到改善, 可溶于甲酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、稀鹽酸等一些有機酸和稀的無機酸, 但不溶于稀硫酸。同時, 由于殼聚糖天然無毒、生物相容性好、可生物降解, 且是一種具有獨特的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的陽離子多糖, 而成為國內(nèi)外的研究熱點, 研究領(lǐng)域主要包括醫(yī)藥[2-4]、農(nóng)業(yè)[5-6]、食品[7-11]、造紙[12-14]、廢水處理[15-17]等, 且其在農(nóng)業(yè)、食品、日用化工等行業(yè)已經(jīng)研發(fā)成功多個產(chǎn)品并得到了廣大用戶的認(rèn)可。

許多研究發(fā)現(xiàn), 殼聚糖具有廣譜的抗植物病原真菌活性。Benhamou等[18]發(fā)現(xiàn)1 mg/mL的殼聚糖可防治由鐮刀菌所引起的番茄莖腐病, 抑制效果為70%。董秋洪等[19]研究表明, 殼聚糖對辣椒疫霉病菌的抑制效果最高可達 91.7%, 水稻惡苗病菌的抑制效果最高達68.4%。蘇村水等[20]研究發(fā)現(xiàn), 施用殼聚糖后的木荷和楊梅苗木立枯病的發(fā)病率均降低, 且楊梅的發(fā)病率較未施用殼聚糖的降低達 60.6%～71.5%。由于殼聚糖對部分植物病原真菌的抑制活性,中華人民共和國農(nóng)業(yè)部于2009年將幾丁聚糖批準(zhǔn)為生物農(nóng)藥, 其作用是抗番茄晚疫病。雖然殼聚糖對真菌具有一定的抑制活性, 但僅對少部分菌種具有較好的抑制活性, 大部分抑制活性不高, 且殼聚糖不溶于水和大部分有機溶劑, 使其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用受到了很大限制。殼聚糖分子中含有氨基和羥基三個活性基團, 通過對活性基團進行修飾, 可提高殼聚糖的水溶性和抑菌性、抗氧化性等功能活性, 因此改性是一種提高殼聚糖抑菌活性的有效方法。改性方法主要有交聯(lián)[21-26]、接枝[27]、?；痆28]、磺化[29-35]、羧基化[36-37]、烷基化[38]、硝化[39]、磷酸化[40]、鹵化[41]、螯合[42-45]等多種, 殼聚糖經(jīng)改性后, 在溶解度、生物活性等方面均有了一定程度的改善。

圖1 甲殼質(zhì)(乙?；浚?0%時)、殼聚糖(氨基含量＞50%時)的結(jié)構(gòu)式(n為聚合度)Fig. 1 Structure of chitin (acetyl content ＞ 50 %) and chitosan(amino content ＞50%) (n = polymer degree)

大量研究表明殼聚糖骨架中引入抑菌活性基團可以顯著提高其抑菌活性并拓寬抑菌譜。因此, 本文系統(tǒng)總結(jié)了20年來課題組制備的含氮、含硫、含磷等功能基團殼聚糖衍生物的抑真菌特性, 通過取代基團、取代位點、分子量、電負(fù)性等多種參數(shù)探討了各衍生物對抑菌活性的影響, 為研制新型海洋生物農(nóng)藥提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 含不同活性基團的殼聚糖衍生物及其抗植物病原真菌活性

1.1 殼聚糖含氮衍生物及其抑菌活性

含氮雜環(huán)化合物, 如吡啶、嘧啶、三唑等化合物,生物活性高、選擇性好、對溫血動物及鳥類、魚類的毒性低, 且可篩選出超高效農(nóng)藥而成為研究的熱點[46]。先靈農(nóng)業(yè)化學(xué)品公司、汽巴-嘉基公司、日本組合公司等開發(fā)的嘧啶胺類化合物對灰葡萄孢等病害具有較好的防效, 德國拜耳公司等開發(fā)的三唑類殺菌劑也具有很高的殺菌活性。為了驗證含氮化合物與殼聚糖是否具有協(xié)同增效作用, 本課題組合成了系列殼聚糖含氮衍生物, Qin等[47-49]以殼聚糖為母體, 將高抑菌活性基團三唑基團等引入到殼聚糖分子中, 合成了3-甲基-1, 2, 4-三唑殼聚糖、3-氯甲基-1,2, 4-三唑殼聚糖等五種含氮衍生物, 并研究了他們對黃瓜枯萎病原真菌(F. oxysporum)、蔥紫斑病原真菌(A. porri)、茶炭疽病原真菌(G. theae-sinensis)等多種植物病原真菌的抑制活性, 結(jié)果表明, 高抑菌活性三唑基團的引入, 使殼聚糖的抑菌活性和抑菌譜發(fā)生了明顯的變化, 但并未達到現(xiàn)有三唑類殺菌劑的效果。原料殼聚糖對梨輪紋病原真菌、蘆筍莖枯病原真菌、黃瓜枯萎病原真菌和茶炭疽病原真菌具有較好的抑制活性, 在1 000 μg/mL時, 其抑制率達到81.7%、100%、83.9%和82.5%。而經(jīng)改性后, 殼聚糖1, 2, 4-三唑衍生物對梨輪紋病原真菌、番茄灰葉斑病原真菌、蔥紫斑病原真菌、茶炭疽病原真菌,殼聚糖1, 2, 3-三唑衍生物對番茄灰葉斑病原真菌和蔥紫斑病原真菌均具有較好的抑菌活性, 也就是修飾后的殼聚糖三唑類衍生物對殼聚糖本身抑制效果差的番茄灰葉斑病原真菌、蔥紫斑病原真菌抑制活性均顯著提高, 這說明三唑基團在改變殼聚糖的抑菌譜方面具有很大的作用, 通過引入三唑基團, 可以使殼聚糖的抑菌譜更寬, 應(yīng)用面更廣。另外, 三唑基團的位點對殼聚糖抑菌活性影響顯著, 1, 2, 4-三唑衍生物最高抑制率可達100%, 優(yōu)于殼聚糖1, 2, 3-三唑衍生物的抑菌活性。Qin等還發(fā)現(xiàn), 三唑環(huán)上取代基電負(fù)性和空間位阻對抑菌活性影響較大, 含有強供電性、空間位阻較小的基團的抑菌活性較強。如三唑環(huán)上取代基為甲基的抑菌活性優(yōu)于體積和吸電性都比甲基大的氯甲基, 而含有苯基的抑菌活性最差。對于殼聚糖1, 2, 3-三唑衍生物, 殼聚糖苯甲酸酯-1, 2, 3-三唑強于殼聚糖煙酸酯-1, 2, 3-三唑, 可能是由于電負(fù)性的影響, 吡啶基中氮原子的存在使長鏈狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖1, 2, 3-三唑衍生物的電負(fù)性明顯增強, 化學(xué)穩(wěn)定性相應(yīng)降低, 抑菌活性降低, 而相對于吡啶基, 苯基的電子分布更加均勻, 共軛效應(yīng)更強,抑菌活性增加。

1.2 殼聚糖含硫衍生物及其抑菌活性

含硫化合物是一類重要的合成中間體, 在醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域具有重要的作用。目前已應(yīng)用于殺蟲劑、除草劑、殺菌劑。如將具有非選擇性的除草劑喹唑啉衍生物中的羰基修飾變成磺酰基后, 可成為專一性的對大豆和水稻的除草劑。因此, 此類殺菌劑的研究得到了廣泛關(guān)注[50]。本課題組Zhong[51-54]、Qin[55-60]等依據(jù)生物等排等原理, 將磺酰胺、異硫氰酸酯、?；s氨基硫脲、縮氨基硫脲基團、二硫代氨基氨基甲酸酯(鹽)等高抑菌活性的含硫基團導(dǎo)入殼聚糖分子中, 得到了系列新型殼聚糖含硫衍生物 40余種,如烷基縮氨基硫脲、殼聚糖二硫代氨基甲酸酯等。鐘志梅等研究了殼聚糖磺酰胺類衍生物、?；惲蚯杷狨ヮ愌苌铩Ⅴ；s氨基硫脲類衍生物對棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp. Vasinfectum)、葡萄炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Saec]、黃瓜灰霉病菌[Pseudoperonospora cubeneis(Berk et cort)Rostuv]等植物病原真菌的抑制活性, 探討了取代基的空間效應(yīng)、衍生物分子量、濃度、取代基種類等對其抑制植物病原真菌活性的影響。發(fā)現(xiàn)取代基的空間效應(yīng)、衍生物的分子量和電負(fù)性對于植物病原真菌的抑制效果影響顯著。吸電子空間誘導(dǎo)效應(yīng)和較大的分子量其抑菌效果較強, 如分子量 200 kDa的衍生物(500 μg/mL)對姜葉斑點病菌的相對抑制率達90%, 而57 kDa和7 kDa的衍生物對姜葉斑點病菌的相對抑制率分別為46.67%和40%。而大的空間位阻則導(dǎo)致抑菌活性降低。為了找到具有更高抑制病原真菌活性的含硫化合物, 秦玉坤等就鐘志梅等的工作進行了進一步研究, 在含硫殼聚糖衍生物分子中引入鹵素和苯環(huán)等基團, 獲得了殼聚糖乙?；s鄰氯苯氨基硫脲、殼聚糖乙酰基縮鄰氟苯氨基硫脲、殼聚糖乙?；s鄰三氟甲基苯氨基硫脲等殼聚糖含硫衍生物。探討了鹵素和苯環(huán)引入后, 衍生物抑菌活性的變化, 發(fā)現(xiàn)電負(fù)性依然是影響衍生物活性的重要因素, 氯的吸電性比氟和三氟甲基弱, 因此其抑菌活性強于氟取代基和三氟甲基取代基, 而三氟甲基吸電性最強, 其抑菌活性最弱。但總體來講,引入鹵素和苯環(huán)等基團后, 抑菌效果仍然不佳。為了增強抑菌活性, 對取代基團和結(jié)構(gòu)進行了進一步改進, 合成了不同烷基鏈長度的殼聚糖烷基縮氨基硫脲衍生物, 如乙基、丙基、正丁基、異丁基, 結(jié)果表明殼聚糖取代苯基縮氨基硫脲衍生物的抑制植物病原真菌活性要明顯高于殼聚糖烷基縮氨基硫脲衍生物, 也就是在分子中引入苯環(huán)比引入烷基更加有效。盡管烷基的引入其抑菌活性未得到有效的改善, 但我們發(fā)現(xiàn)碳鏈的長度對抑菌活性有較大影響, 碳鏈越長其抑菌活性越高。為了得到抑菌活性更佳的產(chǎn)品, 將常用農(nóng)藥福美雙的活性基團二硫代氨基甲酸酯引入到殼聚糖骨架中, 制備得到殼聚糖二硫代氨基甲酸甲酯、殼聚糖二硫代氨基甲酸乙酯含硫衍生物。抑菌結(jié)果表明二硫代氨基甲酸酯基團可以提高殼聚糖的抑菌活性和拓寬抑菌譜, 在1 000 μg/mL濃度下, 殼聚糖對茶炭疽病原真菌和蔥紫斑病原真菌抑制活性分別為82.5%和65.1%, 而殼聚糖二硫代氨基甲酸酯衍生物在該濃度下對兩種菌的抑制率均顯著提高, 達到100%。說明通過對殼聚糖含硫衍生物的進一步改進, 有望得到抑菌效果好的生物農(nóng)藥。

1.3 殼聚糖含磷衍生物及其抑菌活性

具有殺菌或抑菌活性的有機磷殺菌劑的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺類等[61]。如對稻瘟病有效的克瘟散、稻瘟凈等防治白粉病的磷酰胺類產(chǎn)品TH184-F和硫代磷酸酯類產(chǎn)品Hoe2873等, 大多具有內(nèi)吸殺菌活性, 殘留低, 但長期使用卻使病原菌產(chǎn)生抗藥性, 且有機磷殺菌劑的類型間也會產(chǎn)生負(fù)交互擾性, 給農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)帶來極大威脅,對其進行改性, 減少副作用和抗性是解決問題的關(guān)鍵。殼聚糖天然無毒, 是一個很好的載體, 將膦酸酯基團接枝到殼聚糖上, 使衍生物既能發(fā)揮有機磷的高效殺菌活性, 又能保持殼聚糖本身所具有的天然無毒副作用、可降解、生物相容性好的特性。本課題組Zhong等[62-63]制備了20種不同分子量、不同取代基的殼聚糖含磷衍生物。研究了烷基鏈長度對殼聚糖含磷衍生物抑菌活性的影響, 發(fā)現(xiàn)烷基磷酸酯殼聚糖衍生物中, 丁基膦酸酯殼聚糖抑菌活性大于丙基膦酸酯殼聚糖, 丙基大于乙基, 說明烷基鏈越長, 其抑菌活性越強, 該結(jié)果與李在國等[64]的研究結(jié)果一致, 李在國等發(fā)現(xiàn)α-氨基烷基膦酸酯中α-位烷基的大小會影響 α-氨基的親核性, 并對其生物活性有影響。為進一步確定取代基對抑制植物病原真菌活性的影響, Zhong等[62]將 α-位用含不同取代基的苯環(huán)基團替代烷基基團, 探討衍生物的結(jié)構(gòu)和抑菌活性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)可能由于強給電子基團-OH對于苯環(huán)誘導(dǎo)效應(yīng)的影響, α-位取代基為水楊基的衍生物抑菌活性大于為苯基的衍生物, 且優(yōu)于 α-氨基烷基膦酸酯衍生物。在實驗室原有烷基、芳香基的基礎(chǔ)上, Qin等[65-66]進一步研究了雜環(huán)基團對殼聚糖含磷衍生物的抑菌活性的影響, 制備了殼聚糖 α-氨基雜環(huán)基膦酸酯衍生物 5種, 即苯氧基嘧啶膦酸甲酯、苯氧基嘧啶膦酸乙酯、正丙基膦酸乙酯、呋喃基膦酸甲酯和呋喃基膦酸乙酯。Qin等發(fā)現(xiàn)5種含磷殼聚糖衍生物均具有很好的抑菌效果和廣譜的抑菌性。相較于殼聚糖抑制效果較差的花生菌核病原真菌、番茄早疫病原真菌和番茄灰葉斑病原真菌, 5種含磷衍生物對三種真菌的抑制率超過80%,與三唑酮和多抗霉素抑制效果相當(dāng)。對黃瓜枯萎、蘆筍莖枯、蔥紫斑、茶炭疽、梨輪紋病原真菌的抑制作用尤其有效, 在測試濃度下抑制效果均達到了100%, 優(yōu)于多抗霉素和三唑酮, 具有潛在的開發(fā)為新型高效、環(huán)境相容好、無殘留的生物農(nóng)藥的價值。

2 結(jié)論與展望

殼聚糖作為一種天然的聚陽離子多糖, 在不同領(lǐng)域顯示出許多優(yōu)秀的活性。許多研究表明殼聚糖具有廣譜抗植物病原真菌活性。但由于殼聚糖為天然產(chǎn)物, 與化學(xué)農(nóng)藥相比, 其殺菌活性較弱, 達到較好殺菌或抑菌效果時所用劑量較大, 相應(yīng)的成本增高, 推廣起來較為困難, 從而限制了其應(yīng)用。對其進行衍生化提高其抗菌活性成為有效途徑。為了尋找在生物農(nóng)藥方面有發(fā)展前景的新型殼聚糖衍生物,本論文介紹了含氮、含硫、含磷的 200余個殼聚糖衍生物及其抑菌活性特性。發(fā)現(xiàn)衍生物抑菌活性不僅受真菌類型的影響, 而且在很大程度上還受其衍生化的基團、取代基電負(fù)性、空間位阻、衍生物的正離子形式、正電性強弱、分子量大小等的影響。一般而言, 空間位阻的增大, 抑菌活性降低, 結(jié)構(gòu)單元中 P-π共軛與苯環(huán)的二面角越大, 抑菌效果越好;取代基的電負(fù)性不同, 抑菌活性受到較大影響, 含有強的供電性的基團抑菌效果越好; 分子量較大(如200 kDa), 抑菌效果較好; 引入雜環(huán)的抑菌效果優(yōu)于苯環(huán), 苯環(huán)優(yōu)于烷基, 烷基鏈越長, 抑菌效果越好。而且發(fā)現(xiàn)各類衍生物的抑菌譜有較大差別。含氮、含硫衍生物只對部分病原真菌具有抑制作用, 而含磷衍生物對研究的供試菌種均具有好的抑制效果。因此, 可根據(jù)靶標(biāo)設(shè)計不同分子量、不同取代基團的衍生物, 其開發(fā)潛力巨大。

雖然殼聚糖及其衍生物在抑制病原真菌方面的研究已經(jīng)有了很多報道, 但仍有許多問題沒有得到解決。主要表現(xiàn)在以下兩個方面： (1)缺乏合理的生物分子設(shè)計, 隨機性較強, 這就造成了很多情況下結(jié)構(gòu)改性后殼聚糖的抑菌活性提高有限, 仍難以與現(xiàn)有殺菌劑相比。(2)目前用于活性研究的殼聚糖及其衍生物多為混合物, 其活性受分子量、脫乙酰度等多重因素影響, 不同的研究中往往活性存在很大的差異, 有些甚至得到截然相反的結(jié)果, 這使得很難準(zhǔn)確評價殼聚糖及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系。如其抑菌的機制尚不明確; 衍生物的穩(wěn)定性、毒理學(xué)評價、對生態(tài)環(huán)境的影響等均未報道。目前有關(guān)殼聚糖抑制植物病原真菌方面的產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品除殼聚糖本身(抑制番茄晚疫病, 登記號PD20102080)外, 均為與含氮、含硫、含磷等農(nóng)藥的復(fù)配產(chǎn)品, 如具有抑制水稻稻瘟病的氨基寡糖素(2%, 殼聚糖的降解產(chǎn)物)與稻瘟酰胺(40%)(登記號PD20170082), 抑制水稻紋枯病的氨基寡糖素(2%)與噻呋酰胺(40%)(登記號 PD20170113),抑制黃瓜霜霉病的幾丁聚糖(1%)和嘧菌酯(登記號PD20161008)等, 直接衍生化的產(chǎn)物還未有產(chǎn)品問世。因此, 上述問題的解決是關(guān)鍵的, 這對研制新型無毒副作用、低或無耐藥性的海洋生物農(nóng)藥具有十分重要的意義。